肠道维利表皮的器官3D培养进行分化
Summary
该程序描述了从小鼠肠道上皮分离，进行分化以确定其器官形成潜力。
Abstract
肠道上皮器官的克隆性归因于其中干细胞的存在。小鼠小肠上皮被分割成墓穴和卵石：茎和增殖细胞被限制在墓穴中，而上皮只包含分化细胞。因此，正常的肠道隐士，但不是病毒，可以产生器官在3D文化。此处描述的程序仅适用于导致茎的脱位的维卢斯上皮。所述方法使用 Smad4 功能丧失：β-卡特宁功能增益 （Smad4 KO：β-卡特宁GOF） 有条件突变鼠标。突变导致肠道病毒分化，并在病毒中产生干细胞。接受脱位的肠道病毒使用玻璃滑梯刮掉肠道，放置在 70 μm 滤网中，并清洗多次，在 BME-R1 矩阵中电镀之前过滤掉任何松散的细胞或凹痕，以确定其器官形成潜力。两个主要标准用于确保产生的器官是从分化的紫罗兰隔间而不是从墓穴中发育出来的：1） 对孤立的 villi 进行微观评估，以确保在 3D 矩阵中电镀之前和之后没有任何系绳的切除器，2） 从 villi 监测器官形成的时间过程。从病毒启动的器官在电镀后仅发生两到五天，并且看起来形状不规则，而来自同一肠道上皮的隐性器官在电镀后的十六小时内就明显出现球形。然而，该方法的局限性是，形成的器官数量和从病毒中启动器官所需的时间因分化程度而异。因此，根据突变的特异性或导致分化的侮辱，必须从经验上确定可以收获病毒以检测其器官形成潜力的最佳阶段。
Introduction
肠道隐士，但不是维利，形成器官时，培养在马特里格尔或BME-R1矩阵。这些器官是自组织结构，通常被称为”迷你肠”，因为存在各种差异化的血统，祖细胞和干细胞存在于肠道上皮在体内。从墓穴中形成器官的可能性归因于干细胞1的存在。另一方面，肠道病毒只由分化细胞组成，因此不能形成器官。然而，突变2或条件，允许去差异的维卢斯上皮可能导致干细胞在维利2，3。这种命运的变化导致在维利上皮的茎可以通过电镀在3D基质中分化的维卢斯上皮来确定其器官形成潜力，作为在维卢斯上皮的去诺沃茎的指标来证实。因此，此过程的关键方面是确保没有墓穴污染。
Smad4KO：β-卡特宁GOF 有条件突变导致肠道上皮的分化，其特征是病毒中增殖和干细胞标记的表达， 最终在被称为异位性墓穴的细胞中形成类似墓穴的结构 这些分离的维利的干细胞的存在是由异位性墓穴（体内）中干细胞标记的表达和突变的维利形成器官的能力决定的镀马特里格尔3。上述程序详细说明了用于确认 Smad4KO：β-卡特宁GOF 突变小鼠中脱位肠道上皮的茎的方法。这种隔离病毒的方法的一个关键特点是使用刮肠流明，而不是EDTA溷合方法4。与 EDTA 溷合方法不同，通过刮擦来隔离维利保留了大部分底层，并允许调整刮擦压力，从而在没有系绳的墓穴的情况下产生 villi。刮擦的压力是主观的操作员，因此，最佳压力，以产生维利没有密码系绳必须由操作员经验决定。此过程的关键方面是通过对 BME-R1 矩阵中电镀前后的 villi 进行微观检查，确保没有墓穴污染。
肠道病毒被刮掉肠道流明与玻璃滑梯，并放置在70μm过滤器和洗涤与PBS摆脱松散的细胞或墓穴，如果有的话，在BME-R1矩阵电镀之前。该方法强调以下标准，以避免墓穴污染：a） 限制 villi 收获的十二指肠的近半部分，其中 villi 是最长的，b） 尽量减少葡萄球产的刮伤数量，c） 通过六井盘中的一系列 PBS 清洗含有 villi 的过滤器，d） 通过在 BME-R1 矩阵中电镀之前和之后的显微检查确认没有墓穴污染。Villi 隔离通过刮擦，而不是通过 EDTA 溷合，防止潜在的介质的完全丧失，可能提供利基信号5，6，7，8，如果需要的话， 从虚列上皮启动器官.
Protocol
Representative Results
Discussion
这种方法可以确认在体内获得干细胞标记的去分化上皮的自我更新能力。正常的肠道上皮可以产生器官从墓穴，但不是维利隔间，当培养在3D，因为干细胞的存在在墓穴1。因此，从3D培养的去差异化的维利上皮培养的器官形成确认干细胞形成从细胞命运逆转。关于肠道上皮因突变和/或损伤引起的细胞命运逆转的报告正在增加2，3，9，10，11，12。<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本出版物得到了国家卫生研究院国家癌症研究所颁发的K22号CA218462-03奖的支持。表达R-斯庞丁1的 HEK293-T细胞是迈克尔·韦尔齐博士的慷慨礼物。
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
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