Segmentering vækst af endotelceller i 6-brønd plader på en Orbital Shaker for mekanobiologiske undersøgelser
Summary
Denne protokol beskriver en belægning metode til at begrænse endotelcelle vækst til et bestemt område af en 6-brønds plade til forskydning stress ansøgning ved hjælp af orbital shaker model.
Abstract
Shear stress pålagt arteriel væg ved strømmen af blod påvirker endotelcelle morfologi og funktion. Lav størrelse, oscillatory og multidirectional shear understreger alle er blevet postuleret for at stimulere en pro-atherosklerotisk fænotype i endotelceller, mens høj størrelse og ensrettet eller enaksial forskydning menes at fremme endotel homeostase. Disse hypoteser kræver yderligere undersøgelser, men traditionelle in vitro-teknikker har begrænsninger og er særligt dårlige til at pålægge cellerne multidirectional shear-belastninger.
En metode, der vinder stigende brug, er at kultur endotelceller i standard multi-well plader på platformen af en orbital shaker; i denne enkle, billige, høj-gennemløb og kronisk metode, den hvirvlende medium producerer forskellige mønstre og størrelser af shear, herunder multidirectional shear, i forskellige dele af brønden. Det har dog en betydelig begrænsning: celler i en region, der udsættes for en type flow, kan frigive mæglere i mediet, der påvirker celler i andre dele af brønden, udsat for forskellige strømme og dermed forvrænge den tilsyneladende relation mellem flow og fænotype.
Her præsenterer vi en nem og overkommelig ændring af metoden, der gør det muligt for celler kun at blive udsat for specifikke forskydningsstressegenskaber. Cellesåning er begrænset til en bestemt region i brønden ved at belægge interesseregionen med fibronectin efterfulgt af passivering ved hjælp af passiveringsopløsning. Derefter kan pladerne hvirvles på rysteren, hvilket resulterer i eksponering af celler for veldefinerede forskydningsprofiler såsom lav størrelse multidirectional shear eller høj størrelse enaksial forskydning, afhængigt af deres placering. Som før giver brugen af standardcellekultur plastartikler ligetil yderligere analyse af cellerne. Ændringen har allerede gjort det muligt at påvise opløselige mæglere, frigivet fra endothelium under definerede forskydningsstressegenskaber, der påvirker celler placeret andre steder i brønden.
Introduction
Reaktionerne fra vaskulære celler på deres mekaniske miljø er vigtige i blodkarrenes normale funktion og i udviklingen af sygdom1. Mekanobiologien af de endotelceller (ECs), der ligger på den indvendige overflade af alle blodkar, har været et særligt fokus for mekanobiologisk forskning, fordi ECs direkte oplever den forskydningsstress, der genereres af blodgennemstrømningen over dem. Forskellige fænotypiske ændringer såsom inflammatoriske reaktioner, ændret stivhed og morfologi, frigivelse af vasoaktive stoffer og lokalisering og ekspression af junctionalproteiner afhænger af EF-eksponering for forskydningsstress2,3,4. Shear-afhængige endotel egenskaber kan også tegne sig for den ujævne udvikling af sygdomme som åreforkalkning5,6,7.
Det er nyttigt at undersøge effekten af forskydning på ECs i kultur, hvor belastninger kan kontrolleres, og ECs kan isoleres fra andre celletyper. Almindeligt anvendt in vitro-enheder til påføring af forskydningsbelastning på ECs omfatter parallelpladeflowkammeret og kegle- og plade-viscometeret, men kun uniaxial steady, oscillatory og pulsatile flow kan påføres8,9. Selv om modificerede flow kamre med tilspidset eller forgrening geometrier og mikrofluidic chips, der efterligner en stenotisk geometri er blevet udviklet, deres lav-throughput og den relativt korte kultur varighed, der er muligt udgør en udfordring10, 11.
Orbital shaker (eller hvirvlende godt) metode til undersøgelse af endotel mekanotransduktion, hvor celler dyrkes i standard cellekultur plasticware placeret på platformen af en orbital shaker, får stigende opmærksomhed, fordi det er i stand til kronisk imponerende komplekse, rumligt varierende forskydning stress mønstre på ECs med høj gennemløb (se gennemgang af Warboys et al.12). Cfd-simuleringer (Computational Fluid Dynamics) er blevet anvendt til at karakterisere den rumlige og tidsmæssige variation af forskydningsstress i en hvirvlende brønd. Den hvirvlende bevægelse af kultur medium forårsaget af orbital bevægelse af shaker platform, hvor pladen er placeret fører til Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, eller putatively pro-aterogen flow) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, eller putativt atheroprotective flow) på kanten af brøndene i en 6-brønd plade. For eksempel er tidsgennemsnit vægforskydningsbelastning (TAWSS) ca. 0,3 Pa i midten og 0,7 Pa på kanten af en 6-brønds plade hvirvlede ved 150 omdrejninger i minuttet med en 5 mm orbital radius13. Metoden kræver kun kommercielt tilgængelige plasticware og orbital shaker selv.
Der er dog en ulempe ved metoden (og andre metoder til at pålægge strømme in vitro): ECs frigive opløselige mæglere og mikropartikler på en forskydningsafhængig måde14,15,16 og denne sekrenom kan påvirke ECs i andre regioner end den, hvor de blev frigivet, på grund af blandingen i det hvirvlende medium. Dette kan maskere de faktiske virkninger af forskydningsstress på EF-fænotypen. For eksempel har Ghim et al. spekuleret i, at dette tegner sig for den tilsyneladende identiske indflydelse af forskellige forskydningsprofiler på transcellulær transport af store partikler17.
Her beskriver vi en metode til fremme af menneskelig navlestrengsåre endotelcelle (HUVEC) vedhæftning i bestemte områder af en 6-brønds plade ved hjælp af fibronectinbelægning, mens du bruger Pluronic F-127 til at passivere overfladen og forhindre vækst andre steder. Metoden løser den ovenfor beskrevne begrænsning, fordi ECs ved at segmentere cellevækst kun oplever én slags forskydningsprofil og ikke påvirkes af sekreter fra ECs, der udsættes for andre profiler andre steder i brønden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den hvirvlende-godt metode er i stand til at generere komplekse flow profiler i en enkelt brønd – Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) på kanten af brønden. Imidlertid vil forskydningsstressmedierede sekreter af opløselig mægler blive blandet i det hvirvlende medium og påvirke celler i hele brønden, hvilket potentielt maskerer den sande effekt af en bestemt forskydningsstressprofil på cellerne.
Den belægningsmetode, der demonstrere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender taknemmeligt et British Heart Foundation-projekttilskud (til PDW), et National Medical Research Council Singapore TAAP og DYNAMO Grant (til XW, NMRC / OFLCG/004/2018, NMRC / OFLCG/001/2017), et A * STAR Graduate Scholarship (til KTP) og et British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (til MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
