Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de revêtement pour limiter la croissance des cellules endothéliales à une région spécifique d’une plaque de 6 puits pour l’application de contrainte de cisaillement à l’aide du modèle de shaker orbital.

Résumé

L’effort de cisaillement imposé sur la paroi artérielle par le flux de sang affecte la morphologie et la fonction endothéliales de cellules. De basse ampleur, les contraintes oscillatoires et multidirectionnelles de cisaillement tous ont été postulés pour stimuler un phénotype pro-athérosclérotique en cellules endothéliales, tandis que l’ampleur élevée et le cisaillement unidirectionnel ou uniaxial sont pensés pour favoriser l’homéostasie endothéliale. Ces hypothèses exigent l’enquête plus approfondie, mais les techniques in vitro traditionnelles ont des limites, et sont particulièrement pauvres à imposer des contraintes de cisaillement multidirectionnel sur des cellules.

Une méthode qui gagne de plus en plus d’utilisation est de culturer des cellules endothéliales dans des plaques multi-puits standard sur la plate-forme d’un agitateur orbital; dans cette méthode simple, peu coûteuse, à haut débit et chronique, le milieu tourbillonnant produit différents modèles et amplitudes de cisaillement, y compris un cisaillement multidirectionnel, dans différentes parties du puits. Cependant, il a une limite importante: les cellules d’une région, exposées à un type d’écoulement, peuvent libérer des médiateurs dans le milieu qui affectent les cellules dans d’autres parties du puits, exposées à des écoulements différents, faussant ainsi la relation apparente entre l’écoulement et le phénotype.

Nous présentons ici une modification facile et abordable de la méthode qui permet aux cellules d’être exposées uniquement à des caractéristiques de contrainte de cisaillement spécifiques. L’ensemencement cellulaire est limité à une région définie du puits en recouvrant la région d’intérêt de fibronectine, suivie d’une passivation à l’aide d’une solution passivante. Par la suite, les plaques peuvent être tourbillonnées sur le shaker, ce qui entraîne l’exposition des cellules à des profils de cisaillement bien définis tels que le cisaillement multidirectionnel de faible magnitude ou le cisaillement uniaxial de magnitude élevée, selon leur emplacement. Comme précédemment, l’utilisation de plastiques de culture cellulaire standard permet une analyse plus approfondie des cellules. La modification a déjà permis la démonstration de médiateurs solubles, libérés par l’endothélium sous des caractéristiques de contrainte de cisaillement définies, qui affectent les cellules situées ailleurs dans le puits.

Introduction

Les réponses des cellules vasculaires à leur environnement mécanique sont importantes dans le fonctionnement normal des vaisseaux sanguins et dans le développement de la maladie¹. La mécanobiologie des cellules endothéliales (CE) qui tapent la surface intérieure de tous les vaisseaux sanguins a été un centre particulier de la recherche mécanobiologique parce que les CE subissent directement le stress de cisaillement généré par le flux sanguin sur eux. Divers changements phénotypiques tels que les réponses inflammatoires, la rigidité et la morphologie altérées, la libération de substances vasoactives, ainsi que la localisation et l’expression de....

Protocole

1. Fabrication de dispositifs et préparation de réactifs

1. Fabrication d’un module en acier inoxydable
   1. Fabriquer le module en acier inoxydable à partir d’un acier inoxydable de nuance 316 à l’aide d’une fraiseuse CNC selon le dessin technique fourni(figure 1).
2. Impression 3D d’un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Préparez un modèle de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D du moule PDMS à l’aide de SolidWorks conformément au dessin technique fourni(Figure 2).
   2. Exportez le modèle CAO vers un fichier STL et importez le fichier STL dans Cura 2.6.2.<....

Résultats

L’adhérence de HUVECs aux régions du plat de puits non revêtues de fibronectin a été abrogée par passivation pluronique F-127 ; La croissance a été confinée à la région recouverte de fibronectine même après 72 h de culture, avec et sans application de contrainte de cisaillement(figure 4A, figure 4C). Sans la passivation pluronique F-127, les HUVECs se sont fixés à la surface sans fibronectine et avaient proliféré davantage de 72 .......

Discussion

La méthode des puits tourbillonnants est capable de générer des profils d’écoulement complexes dans un seul puits - flux multidirectionnel de faible magnitude (LMMF) au centre et écoulement uniaxial de haute magnitude (HMUF) au bord du puits. Cependant, les sécrétions médiées par le stress de cisaillement du médiateur soluble seront mélangées dans le milieu tourbillonnant et affecteront les cellules de l’ensemble du puits, masquant potentiellement le véritable effet d’un profil de stress de cisaillement particulier sur l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine	NA	NA Isolées	à partir de cordons obtenus de donneurs dont le travail n’a pas été compliqué à l’hôpital Hammersmith
Réactifs et matériaux
Alexa Fuor 488-labellisé chèvre anti-lapin IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Sérum bovin Albumine	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Bien Clair Fond Plat Non Traité  ;	Fournitures de laboratoire scientifique Ltd.
Fibronectine du plasma bovin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
TNF humain recombinant	Peprotech	300-01A
RS PRO 2,85 mm Filament d’imprimante 3D PLA noir, 1 kg	RS	832-0264
Acier inoxydable 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Kit d’élastomère de silicone	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Solution trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Anticorps Zonula Occludens-1 (ZO-1)	Technologie de signalisation cellulaire	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd  ;
Microscope confocal Leica TCS SP5	Leica	NA
Misumi		RTWP32-58
Bagues de retenue/Interne/Type C	Misumi	RTWS35
Imprimante Ultimaker 2+3D	Ultimaker	NA
strong>Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA

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