Segmentering av tillväxten av endotelceller i 6-brunnsplattor på en orbital shaker för mekanobiologiska studier
Summary
Detta protokoll beskriver en beläggningsmetod för att begränsa endotel cell tillväxt till en viss region i en 6-brunns platta för shear stress ansökan med hjälp av orbital shaker modell.
Abstract
Shear stress påtvingas på artärväggen genom blodflödet påverkar endotelcellsmorfologi och funktion. Låg magnitud, oscillaterande och multidirectional shear påfrestningar har alla postulerats för att stimulera en pro-atherosclerotic fenotyp i endotelceller, medan hög magnitud och enkelriktad eller enaxial sax tros främja endotelial homeostas. Dessa hypoteser kräver ytterligare undersökning, men traditionella in vitro-tekniker har begränsningar och är särskilt dåliga på att införa multidirectional shear stress på celler.
En metod som får allt större användning är att odla endotelceller i vanliga multibrunnsplattor på plattformen för en orbital shaker; I denna enkla, billiga, hög genomströmning och kroniska metod producerar det virvlande mediet olika mönster och magnitud på sajuvning, inklusive multidirectional sav, i olika delar av brunnen. Det har dock en betydande begränsning: celler i en region, utsatta för en typ av flöde, kan frigöra medlare i mediet som påverkar celler i andra delar av brunnen, utsatta för olika flöden, vilket förvränger det uppenbara förhållandet mellan flöde och fenotyp.
Här presenterar vi en enkel och prisvärd modifiering av metoden som gör det möjligt för celler att exponeras endast för specifika savspänningsegenskaper. Cellfröning är begränsad till en definierad region i brunnen genom att täcka den region som är av intresse med fibronectin, följt av passivering med passiveringslösning. Därefter kan plattorna virvlas på skakapparaten, vilket resulterar i exponering av celler för väldefinierade saxprofiler som multidirektionell sax med låg magnitud eller enaxialsaxialsax med hög magnitud, beroende på deras placering. Som tidigare möjliggör användningen av standard cellkulturartiklar enkel ytterligare analys av cellerna. Ändringen har redan gjort det möjligt att demonstrera lösliga medlare, som frigörs från endotel under definierade savspänningsegenskaper, som påverkar celler som finns någon annanstans i brunnen.
Introduction
Svar från kärlceller på deras mekaniska miljö är viktiga i blodkärlens normala funktion och i utvecklingen av sjukdom1. Mekanobiologin hos de endotelceller (ECs) som kanterar den inre ytan av alla blodkärl har varit ett särskilt fokus för mekanobiologisk forskning eftersom ECs direkt upplever den saxstress som genereras av blodflödet över dem. Olika fenotypiska förändringar såsom inflammatoriska svar, förändrad styvhet och morfologi, frisättning av vasoaktiva ämnen och lokalisering och uttryck av junctional proteiner beror på EG exponering för sax stress2,3,4. Shear-beroende endotel egenskaper kan också förklara ojämn utveckling av sjukdomar såsom åderförkalkning5,6,7.
Det är användbart att studera effekten av sav på ECs i kultur, där påfrestningar kan kontrolleras, och ECs kan isoleras från andra celltyper. Vanliga in vitro-anordningar för applicering av saxspänning på ECs inkluderar parallellplåtens flödeskammare och kon- och plåtviscometern, men endast enaxialt stadigt, svängbart och pulsatilt flöde kanappliceras 8,9. Även om modifierade flödeskammare med avsmalnande eller förgrenande geometrier och mikrofluidiska chips som efterliknar en stenotisk geometri har utvecklats, utgör deras låga genomströmning och den relativt korta kulturtid som är möjlig en utmaning10, 11.
Orbital shaker (eller virvlande väl) metoden för studier av endotel mekanotransduktion, där celler odlas i standard cellkultur plastartiklar placerade på plattformen för en orbital shaker, får allt större uppmärksamhet eftersom den kan kroniskt införa komplexa, rumsligt varierande sax stressmönster på ECs med hög genomströmning (se granskning av Warboys et al.12). Beräkningsvätska dynamik (CFD) simuleringar har använts för att karakterisera rumsliga och tidsmässiga variationen av shear stress i en virvlande brunn. Den virvlande rörelsen hos odlingsmediet som orsakas av omloppsrörelsen hos den shakerplattform på vilken plattan placeras leder till multidirektionellt flöde med låg magnitud (LMMF, eller förföriskt pro-aterogent flöde) i mitten och Uniaxial Flow med hög magnitud (HMUF, eller putativt ateroprotektivt flöde) vid kanten av brunnarna på en 6-brunnsplatta. Till exempel är tidsgenomsnittad väggsjuvspänning (TAWSS) cirka 0,3 Pa i mitten och 0,7 Pa vid kanten av en 6-brunnsplatta virvlad vid 150 varv/min med en 5 mm omloppsradie13. Metoden kräver endast kommersiellt tillgängliga plastartiklar och själva orbital shakern.
Det finns dock en nackdel med metoden (och andra metoder för att införa flöden in vitro): ECs släpper lösliga medlare och mikropartiklar på ett savberoende sätt14,15,16 och denna secretome kan påverka ECs i andra regioner än den där de släpptes, på grund av blandningen i det virvlande mediet. Detta kan dölja de faktiska effekterna av sax stress på EG fenotyp. Till exempel har Ghim et al. spekulerat i att detta står för det till synes identiska inflytandet av olika savprofiler på transcellulär transport av stora partiklar17.
Här beskriver vi en metod för att främja mänsklig navelsträngsmörjningscell (HUVEC) vidhäftning i specifika regioner av en 6-brunnsplatta med fibronectinbeläggning medan du använder Pluronic F-127 för att passivera ytan och förhindra tillväxt någon annanstans. Metoden löser den begränsning som beskrivs ovan eftersom ECs, genom att segmentera celltillväxt, endast upplever en typ av savprofil och inte påverkas av secretomes från ECs som exponeras för andra profiler någon annanstans i brunnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden med virvlande brunn kan generera komplexa flödesprofiler i en enda brunn – LMMF (Low Magnitude Multidirectional Flow) i mitten och High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) vid brunnens kant. Skevning stressmedlade sekret av löslig medlare kommer dock att blandas i det virvlande mediet och påverka celler i hela brunnen, vilket potentiellt döljer den sanna effekten av en viss savspänningsprofil på cellerna.
Den beläggningsmetod som demonstreras här övervinner denna fråga genom att b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt ett british heart foundation-projektbidrag (till PDW), ett nationellt medicinskt forskningsråd Singapore TAAP och DYNAMO Grant (till XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), ett A * STAR Graduate Scholarship (till KTP) och ett British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (till MA).
Materials
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
