Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas

Summary

Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo sobre cómo construir un microscopio de espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual (svFCS) para medir la difusión molecular en la membrana plasmática de las células vivas.

Abstract

Los procesos biológicos dinámicos en las células vivas, incluidos los asociados con la organización de la membrana plasmática, ocurren en varias escalas espaciales y temporales, que van desde nanómetros hasta micrómetros y microsegundos a minutos, respectivamente. Una gama tan amplia de procesos biológicos desafía los enfoques de microscopía convencionales. Aquí, detallamos el procedimiento para implementar mediciones de espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual (svFCS) utilizando un microscopio de fluorescencia clásico que se ha personalizado. El protocolo incluye una comprobación específica del rendimiento de la configuración de svFCS y las directrices para las mediciones de difusión molecular por svFCS en la membrana plasmática de células vivas en condiciones fisiológicas. Además, proporcionamos un procedimiento para interrumpir los nanodominios de la balsa de membrana plasmática mediante el tratamiento con colesterol oxidasa y demostramos cómo estos cambios en la organización lateral de la membrana plasmática podrían ser revelados por el análisis svFCS. En conclusión, este método basado en la fluorescencia puede proporcionar detalles sin precedentes sobre la organización lateral de la membrana plasmática con la resolución espacial y temporal adecuada.

Introduction

La complejidad de la organización de la membrana plasmática
La comprensión actual de la organización de la membrana celular tiene que tener en cuenta varios aspectos¹. En primer lugar, una composición lipídica compleja varía no solo entre los tipos de células, sino también dentro de una sola célula (orgánulos de membrana / membrana plasmática). Además, las proteínas de membrana asociadas o intrínsecas se organizan principalmente en complejos multiméricos dinámicos, con grandes dominios que se extienden fuera de la membrana, lo que representa un área significativamente mayor que la de los dominios transmembrana solos. Además, las proteínas asociadas a la membrana exhiben capacidades específicas de unión a lípidos o de interacción lipídica que desempeñan un papel en la regulación de la función de las proteínas. Estos dependen directamente de la composición local y la accesibilidad de los lípidos².

Finalmente, se observa un nivel significativo de asimetría entre dos valvas de membrana debido a la estructura asimétrica intrínseca de las proteínas de membrana y la distribución de lípidos. De hecho, un equilibrio metabólico lipídico entre síntesis e hidrólisis, combinado con flip-flop lipídico entre los folíolos, genera tal distribución asimétrica. Como cualquier transporte a través de la bicapa está limitado por la energía libre requerida para mover el grupo de cabeza polar a través del interior hidrófobo de las membranas, generalmente es asistido por transportadores selectivos. Para cada tipo de célula, la asimetría tiende a mantenerse firmemente. En conjunto, estos factores contribuyen a la inhomogeneidad lateral o compartimentación de la membrana plasmática ^3,4.

Enriquecemos esta representación de la membrana plasmática teniendo en cuenta la difusión molecular intrínseca dentro y a través de la bicapa, lo que contribuye a la heterogeneidad lateral dinámica en una escala de décimas a cientos de nanómetros y microsegundos a segundos. Por ejemplo, los nanodominios de membrana dependientes de lípidos, las llamadas balsas lipídicas, definidas como colesterol, y las plataformas de señalización ricas en esfingolípidos, contribuyen a la compartimentación de la membrana plasmática ^5,6. Sin embargo, la visión actual de la organización de la membrana no se limita solo a las balsas lipídicas. Los nanodominios de membrana son más complejos y heterogéneos en composición, origen y función. Aún así, su presencia en la membrana plasmática tiene que estar estrechamente coordinada, y las interacciones dinámicas entre proteínas y lípidos parecen ser importantes en la distribución espacial y la modificación química de los nanodominios de membrana 1,3,7,8.

El principio svFCS y su aplicación para sondear la organización de la membrana plasmática
Aunque se ha avanzado mucho en el análisis de los dominios de membrana, principalmente a través de técnicas biofísicas, los determinantes que dictan la organización local de la membrana plasmática deben refinarse con una resolución espacial y temporal adecuada. Los determinantes basados en el seguimiento de moléculas individuales proporcionan una excelente precisión espacial y permiten la caracterización de diferentes modos de movimiento ^9,10,11,12, pero tienen una resolución temporal limitada con velocidades de fotogramas de cámara clásicas bajas y requieren un esfuerzo más experimental para registrar un número significativo de trayectorias. Alternativamente, el coeficiente de difusión de los componentes de la membrana puede evaluarse mediante recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)¹³ o espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)¹⁴. Este último ha recibido más atención, principalmente debido a su alta sensibilidad y selectividad, volumen de detección microscópica, baja invasividad y amplio rango dinámico¹⁵.

La base conceptual de FCS fue introducida por Magde y sus colegas hace unos 50 años ^16,17. Se basa en registrar la fluctuación de la emisión de fluorescencia con una alta resolución temporal (de μs a s)¹⁸. En su versión moderna, las mediciones en células vivas se realizan mediante un pequeño volumen de excitación confocal (~ 0.3 femtitolitros) colocado dentro de una región de interés (por ejemplo, en la membrana plasmática); la señal de fluorescencia generada por la difusión de moléculas fluorescentes que entran y salen del volumen de observación se recoge con una resolución temporal muy alta (es decir, el momento de llegada de cada fotón al detector). Luego, se calcula la señal para generar la función de autocorrelación (ACF), a partir de la cual se extrae el tiempo promedio t_d (tiempo de difusión) durante el cual una molécula permanece dentro del volumen focal, junto con el número medio de partículas, (N), presente en el volumen de observación, que es inversamente proporcional a la amplitud del ACF. Este último parámetro podría ser información útil sobre la concentración de moléculas dentro del volumen de observación.

Desde entonces, se ha implementado un número creciente de modalidades de FCS gracias al rápido desarrollo de la instrumentación en biofotónica, lo que permite la descripción de fenómenos dinámicos que ocurren en sistemas vivos. Aún así, una especie molecular experimentaría una distribución más superpuesta de los valores del coeficiente de difusión, que generalmente se refleja en una característica de difusión anómala, en la que las moléculas se difunden con una relación no lineal en el tiempo¹⁹, y dificultad para identificar el significado biológico de esta subdifusión anómala. En el pasado, esta dificultad se ha superado de alguna manera mediante el registro de la difusión molecular por FRAP desde áreas de varios tamaños, en lugar de desde un solo área, proporcionando así información espacial adicional. Esto permitió, por ejemplo, la conceptualización de los microdominios de membrana 20,21,22.

Se estableció una traducción de esta estrategia a las mediciones de FCS (es decir, la llamada espectroscopia de correlación de fluorescencia de variación puntual (svFCS)) variando el tamaño del volumen focal de observación, lo que permite registrar la fluctuación en la fluorescencia en diferentes escalas espaciales²³. Por lo tanto, el enfoque svFCS proporciona información espacial indirecta que permite la identificación y determinación de los modos de difusión molecular y el tipo de partición de membrana (dominios aislados versus contiguos²⁴) de las moléculas estudiadas. Al trazar el tiempo de difusión t_d en función de las diversas escalas espaciales definidas por el valor de la cintura (ω), que corresponde al tamaño del radio del haz de detección en este caso^23,25, se puede caracterizar la ley de difusión de una molécula dada en una condición fisiológica dada. El svFCS es, por lo tanto, un análogo perfecto al seguimiento de una sola partícula en el dominio del tiempo²⁶. Bajo la restricción de difusión browniana, se debe esperar una relación estrictamente lineal entre el tiempo de difusión t_d y la cintura ω (Figura 1)^23,25. El origen de la desviación de la ley de difusión de este esquema puede atribuirse a razones no exclusivas, como la malla del citoesqueleto, el apiñamiento molecular, la partición dinámica en nanodominios o cualquier combinación de estos y otros efectos (Figura 1), y debe probarse experimentalmente²⁵.

Aquí proporcionamos todos los puntos de control necesarios para el uso diario de un sistema óptico svFCS hecho a medida construido desde cero, que complementa nuestras revisiones de protocolo anteriores^27,28 sobre ese enfoque experimental. Además, como prueba de concepto, damos pautas con respecto a la calibración de la configuración, la preparación de células, la adquisición de datos y el análisis para el establecimiento de la ley de difusión svFCS (DL) para Thy1-GFP, una proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol de membrana plasmática, que se sabe que está localizada en nanodominios de balsa lipídica²⁹. Finalmente, demostramos cómo la desestabilización parcial de los nanodominios de balsas lipídicas por el tratamiento con colesterol oxidasa afecta las propiedades de difusión de Thy1-GFP. Además, se proporciona una descripción detallada de la construcción de una configuración svFCS desde cero en material complementario.

Protocol

1. Especificación de configuración para ensamblar una configuración svFCS personalizada NOTA: La simplicidad de la configuración propuesta de svFCS permite una fácil instalación, operación y mantenimiento a un bajo costo, al tiempo que garantiza la eficiencia en la recuperación de fotones. Para obtener más información, consulte Material complementario. Sala experimental y seguridad Instale el sistema en una habitación estabilizada a unos 21 °C. Evite el flujo de aire directo en la mesa óptica pasiva (o activa) y siga las reglas de seguridad láser para la alineación óptica. Hardware y softwareNOTA: El material complementario detalla los pasos de instalación representados en la Figura 2. Escriba el software principal de adquisición y control en LabVIEW utilizando una arquitectura de estructura de eventos y máquinas de estado donde una placa de adquisición multifunción impulsa la mayoría de los controladores.NOTA: El correlacionador, el láser y el medidor de potencia son controlados o monitoreados por su propio software. Adaptar los procedimientos de instalación de hardware y software según el hardware utilizado. Configuración ópticaNOTA: La Figura 3 ilustra los módulos de banco óptico utilizados en las siguientes secciones para controlar la calidad de las alineaciones ópticas. Todas las especificaciones de los elementos ópticos se enumeran en la Tabla de materiales. El procedimiento para construir la configuración está ampliamente detallado en Material complementario. Este sistema comprende un láser de onda continua, un microscopio invertido motorizado equipado con un objetivo de agua de inmersión, un detector de fotodiodos de avalancha acoplado a un solo módulo de conteo de fotones y un correlacionador de hardware. Una cámara de incubación de microscopio con calentadores libres de vibraciones ha sido especialmente diseñada para controlar la temperatura para experimentos en células vivas. Por convención, el eje XY corresponde al plano perpendicular de la ruta óptica, y el eje Z corresponde a la ruta óptica. 2. Punto de control diario antes de ejecutar el experimento Controlar la trayectoria de excitación (Figura 3, & ). Abra todos los diafragmas del iris. Mida la potencia del láser con el medidor de potencia, manteniendo el primer iris completamente abierto. Gire la placa de media onda (HWP) para encontrar la potencia máxima. Compruebe la alineación utilizando el iris si la potencia del láser es inferior a la habitual, y mueva L1 y M1 alternativamente, si es necesario. Anote el valor de potencia en el cuaderno de laboratorio del experimento. Controlar la ruta de detección (Figura 3, & ). Coloque el agua, un cubrehojas y una gota de una solución de rodamina 6G (Rh6G) de 2 nM en el objetivo. Si la señal de fluorescencia (número de conteo en el APD, grabado con el software LabVIEW) es más baja de lo habitual, rehaga la solución Rh6G, verifique el posicionamiento y el número de la cubierta en la lente del objetivo, o elimine las burbujas, si las hay. Si la señal de fluorescencia sigue siendo más baja de lo habitual, coloque el medidor de potencia dentro de la trayectoria óptica para bloquear el haz. Apague el APD (en adelante, APD se refiere al APD y al módulo de conteo de fotones únicos). Retire la muestra. Limpie y reemplace la lente del objetivo con un objetivo reflectante. Compruebe el rayo láser en el objetivo reflectante retirando el medidor de potencia de la trayectoria de la luz. Asegúrese de que el haz del objetivo esté centrado y que el reflejo posterior alcance el primer iris de la línea (Figura 3). De lo contrario, ajuste la posición central con M2 o el reflejo posterior con el espejo dicroico. Si el acoplamiento del microscopio es correcto, empuje la lente del objetivo hacia atrás, agregue una gota de agua, un cobertor y una gota de una solución Rh6G más concentrada (es decir, 200 nM) y establezca una potencia láser más baja que para las mediciones clásicas (pocos μW). Encienda el APD y optimice la alineación APD y estenopeica, alternativamente, con sus respectivos tornillos de ajuste XYZ mientras monitorea la señal de intensidad (software LabVIEW). Cambie el deslizamiento de la cubierta y agregue una menor concentración de Rh6G (2 nM). Mueva el agujero de alfiler a lo largo del eje Z para encontrar una posición en la que la relación de brillo molecular aumente y la cintura sea mínima. Cierre el iris hasta que la señal disminuya: el tamaño del rayo láser alcanza el tamaño de apertura posterior del objetivo (es decir, el tamaño mínimo de la cintura, consulte Material suplementario). Inicie el software del correlacionador y registre los datos (consulte la sección 7 para el registro de datos). Compruebe el ACF, que debe mostrar una baja cantidad de ruido, dar un tamaño de cintura pequeño y una alta tasa de recuento por molécula por segundo (ver sección 7 para el análisis de datos y la evaluación del tamaño de la cintura). 3. Consideraciones generales para el registro y análisis de datos svFCS Registre y analice los datos de fluorescencia siguiendo este esquema general (consulte las secciones 7, 8 y 9): (1) registro de fluorescencia y generación de ACF (software de correlación), (2) descarte inesperado de datos, un promedio de datos retenidos, que se ajuste al modelo apropiado (con software Igor Pro casero), (3) diagrama de ley de difusión (software matlab casero 1) y (4) comparación de ley de difusión opcional (software MATLAB casero 2). Los diferentes programas de software están disponibles bajo petición.NOTA: El correlacionador de hardware tiene un tiempo de muestreo mínimo de 12,5 ns (es decir, una frecuencia de muestreo de 80 MHz). Proporciona una resolución temporal que es al menos 1.000 más baja que el tiempo residente típico de difusión libre de moléculas pequeñas en solución y 106 más pequeña que el tiempo de difusión de proteínas de membrana dentro de un volumen de observación confocal. 4. Cultivo celular y transfección Sembra las células Cos7 en un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos con fondo de vidrio de borosilicato # 1.0 a una densidad de 10,000 células / pozo utilizando el Medio Eagle Modificado (DMEM) completo de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 5%, penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 U / mL) y L-glutamina (1 mM). Cultive las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante 24 h. Retire el medio, agregue 300 μL del medio de cultivo completo fresco por pocillo y preincuba las células durante 30 min a 37 °C. Diluir 0,5 μg del ADN plásmido que codifica la proteína Thy-1 fusionada con eGFP25 en 50 μL de DMEM sin suero. Vórtice brevemente para mezclar. Diluya 1,5 μL del reactivo de transfección de ADN en 50 μL de DMEM sin suero y mezcle bien la solución. Agregue el reactivo de transfección diluido directamente en la solución de ADN preparada y mezcle los compuestos inmediatamente. Incubar la mezcla preparada durante 10 a 15 min a temperatura ambiente. Agregue 10 μL de los complejos combinados de ADN / reactivo de transfección en forma gota a gota en el medio en cada pozo, y homogeneice girando suavemente la placa. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h. Después de la incubación, reemplace el medio que contiene complejos de REACTIVO DE ADN / transfección con 400 μL de DMEM completo fresco y cultive las células durante 16 h antes del experimento svFCS. 5. Preparación de células para mediciones de svFCS Elimine el medio de cultivo. Lave las células suavemente dos o tres veces con el tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank sin suero que contiene Ca2+ y Mg2+ suplementado con 10 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico) (HEPES), pH 7.4 (HBSS/HEPES). Mantenga las celdas en el búfer HBSS/HEPES durante todas las adquisiciones de svFCS. 6. Tratamiento farmacológico Retire el medio de cultivo y lave las células dos o tres veces con HBSS sin suero suplementado con 10 mM HEPES, pH 7.4 (HBSS/HEPES). Incubar las células con 1 U/ml de solución de colesterol oxidasa (COase) en tampón HBSS/HEPES durante 1 h a 37 °C. Retire la solución y mantenga las células en presencia de 0,1 U/ml de COase en el búfer HBSS/HEPES mientras realiza las mediciones de svFCS. 7. Calibración del tamaño del punto Precalentar la cámara del microscopio a 37 °C. Preparar una solución estándar de 2 nM de Rh6G por dilución en serie. Deje caer 200 μL de solución 2 nM Rh6G sobre una cubierta de vidrio colocada en el objetivo de inmersión en agua. Inicie todo el hardware y software. Mida y ajuste la potencia del rayo láser de 488 nm a 300 μW. Dependiendo del brillo y la fotoestabilidad de la sonda fluorescente utilizada, adapte esta potencia de acuerdo con (1) la intensidad de fluorescencia (en el software LabVIEW), que debe ser estable, (2) la forma ACF (en el software del correlacionador), que debe tener una forma constante a lo largo del tiempo, y (3) los parámetros de ajuste que dan un tamaño de cintura pequeño y una alta tasa de recuento por molécula (fotones por molécula por segundo, típicamente de pocas decenas a cientos de fotones por molécula por segundo).NOTA: La amplitud del ACF (llamado G(0)) es inversamente proporcional al número de la molécula (es decir, la concentración de la sonda fluorescente). Para la calibración del tamaño de la cintura, este es un buen parámetro candidato de control de calidad. Por lo tanto, G(0) debe ser similar para la misma concentración de un día a otro, ya que vincula el tamaño de la cintura y la concentración. Para las mediciones celulares, como FCS es más preciso para baja concentración, G(0) debe ser alto para la extracción adecuada del ajuste de parámetros. Configure el puerto del microscopio de iluminación/detección svFCS con el software LabVIEW. Encienda el APD. Cierre el iris hasta que la señal baje para obtener el tamaño mínimo de la cintura, o ciérrelo para un tamaño de cintura más grande. Registre varios ACF de duración seleccionada (es decir, una ejecución) para mejorar la reproducibilidad estadística, generalmente 10 ejecuciones que duran 20 s cada una con el software del correlacionador. Apague el APD. Utilice el software Igor Pro para comprobar y descartar las tiradas con fuertes fluctuaciones debidas a agregados moleculares. Realice este paso manualmente: debe ser independiente del usuario después de que los usuarios hayan sido entrenados. Ajuste el promedio de los ACF retenidos con un modelo de difusión 3D. Extraiga de los parámetros de ajuste el tiempo de difusión promedio y guárdelo en un archivo “.txt” (el formato de archivo es dictado por el software Igor Pro). Verifique la tasa de recuento por molécula por segundo (un buen indicador de rendimiento) dividiendo la intensidad promedio (extraída de la traza de fluorescencia) por el número de moléculas (extraídas del ACF).NOTA: Asegúrese de que este valor es alto y estable día a día para los mismos parámetros de adquisición. Conociendo el coeficiente de difusión de Rh6G en solución acuosa a 37 °C (D) y (ver 7.13), calcule el tamaño experimental de la cintura ω de acuerdo con: . Aplicar el procedimiento para cada modificación del tamaño de la cintura requerida para trazar la ley de difusión FCS y antes de cualquier nueva serie experimental de adquisición de datos svFCS. 8. Adquisiciones de datos svFCS en células Mida y ajuste la potencia del haz de 488 nm entre 2 y 4 μW. Dependiendo del brillo y la fotoestabilidad de la sonda fluorescente utilizada, adapte esta potencia para permitir una alta tasa de recuento por molécula (generalmente varios miles de fotones por molécula por segundo), manteniendo el fotoblanqueo bajo (es decir, un rastro de intensidad estable en el software LabVIEW). Equilibre las muestras durante 10 min a 37 °C antes de comenzar las mediciones. Ajuste el microscopio de iluminación de epifluorescencia con el software LabVIEW. Elija una celda con una ubicación de sonda fluorescente adecuada y una intensidad de señal de fluorescencia (baja).NOTA: Cuanto menor sea la fluorescencia, mejores serán las mediciones de FCS (consulte el paso 8.1). Configure el puerto del microscopio de iluminación/detección svFCS con el software LabVIEW. Encienda el APD. Realice un xy-scan de la celda seleccionada con el software LabVIEW. Realice un escaneo z y ubique el punto confocal en la intensidad máxima de fluorescencia eligiendo la membrana plasmática en la parte superior e inicie la adquisición de datos. Para maximizar la separación entre las dos membranas, preferiblemente realice el escaneo en el área nuclear de la célula. Grabe una serie de 20 ejecuciones que duren 5 s, cada una con el software del correlacionador.NOTA: Asegúrese de que la duración de cada ejecución sea lo suficientemente larga como para obtener ACF con ruido reducido. Las adquisiciones largas son susceptibles al fotoblanqueo o a variaciones sustanciales inesperadas (por ejemplo, agregados). Adapte el número de tiradas, su duración y el número de series a las muestras, pero asegúrese de que permanezcan constantes dentro de la misma masa de experimentos para su reproducibilidad. Apague el APD. Descarte las ejecuciones inesperadas con el software Igor Pro. Ajuste el ACF promedio con un modelo de difusión 2D de 2 especies. Adaptar este modelo al tipo de comportamiento de difusión de la molécula diana. Guarde los parámetros de conexión en el archivo anterior (consulte el paso 7.13). Realice de 10 a 15 series de grabaciones en al menos 10 celdas diferentes y reproduzca los pasos 8.3 a 8.13. Compruebe que el único archivo obtenido contiene la información sobre el tamaño de la cintura y los parámetros de ajuste de las 10 a 15 grabaciones. Para establecer una sola ley de difusión, analice al menos cuatro tamaños de cintura que varían entre 200 y 400 nm. Este rango está definido por el límite óptico de difracción, pero depende del objetivo (apertura numérica) y del láser (longitud de onda).NOTA: Como la calibración del tamaño de la cintura no es absoluta y tiene cierto grado de incertidumbre, se creó un software MATLAB28 dedicado que tiene en cuenta el error x e y (es decir, ω2 y td) para ajustarse a la ley de difusión. Inicie el software MATLAB 1 y seleccione una carpeta que contenga todos los archivos “.txt” correspondientes a al menos cuatro experimentos de tamaño de cintura. La trama <td> versus <ω2>, es decir, la ley de difusión. Se pueden extraer dos parámetros principales: la intersección del eje y (t0) y el coeficiente de difusión efectivo (Deff, inversamente proporcional a la pendiente). 9. Leyes de difusión de diferentes condiciones experimentales de comparación NOTA: Si es necesario, reproduzca las secciones 7 y 8 para diferentes condiciones experimentales. Se desarrolló un software dedicado (software MATLAB 2) para determinar si estas leyes de difusión son similares o no de acuerdo con los valores t0 y Deff 28. Prueba dos hipótesis: los dos valores son diferentes, o los dos valores no son diferentes en un umbral establecido por encima de una probabilidad de falsa alarma (PFA). Un valor arbitrario de PFA del 5% (T = 3,8) se considera el límite superior de significación entre dos parámetros (t0 o Deff), lo que indica que solo hay un 5% de posibilidades de que los dos valores sean idénticos. Cree un archivo “.xls” que contenga los valores característicos de la ley de difusión de cada condición para comparar (es decir, un archivo que contenga el error t0, t0 , Deff y Deff para las condiciones no tratadas (NT) y tratadas (COase) como una tabla). Inicie el software MATLAB 2. Seleccione el archivo “.xls”. Analice la gráfica 2D codificada por colores generada, donde las pruebas estadísticas t0 y Deff se graficarán en los ejes x e y, respectivamente (Figura 4). Cuanto mayor es T, mayor es la diferencia entre los valores comparados. 10. Mediciones de la concentración de colesterol Tratamiento celular y lisis Sembrar las células de Cos7 por triplicado en placas de 6 pocillos a 4 × 105 células/pozo e incubar en 2 mL de DMEM completo a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche para permitir que las células se adhieran a la placa. Retire el medio de cultivo y lave las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 1 ml de tampón HBSS/HEPES que contenga (o no, para los controles) 1 U/ml de coase, e incubar durante 1 h a 37 °C con un 5% de CO2. Sustituir el medio por 1 ml de HBSS/HEPES que contenga 0,1 U/ml de coase, e incubar durante 1 h a 37 °C con 5% de CO2. Retire la solución y recolecte las células. Lave las células tres veces con PBS y centrífuga a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Lisar las células con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM de ácido tetraacético etilendiamina, 2% de glicerol, proteasa y cóctel inhibidor de la fosfatasa) durante 30 min en hielo. Centrifugar los lisados a 10000 × g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Cuantificar la concentración total de proteínas para cada muestra mediante el ensayo de proteínas de Bradford modificado utilizando la solución de trabajo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Medición de la concentración de colesterol Para determinar el nivel de colesterol celular total enzimáticamente, use el kit apropiado (por ejemplo, Amplex Red Cholesterol Assay Kit) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para cada reacción, mezcle la muestra que contiene 5 μg de proteína con la solución de trabajo Amplex Red reactivo/peroxidasa de rábano picante/colesterol oxidasa/colesterol esterasa, e incube durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Mida la fluorescencia utilizando una excitación de 520 nm y detecte la emisión a 560-590 nm utilizando un lector de microplacas. Reste el fondo del valor final y determine la concentración de colesterol utilizando una curva estándar. Calcular el contenido final de colesterol en ng de colesterol por μg de proteína.

Representative Results

Generamos un DL para Thy1-GFP expresado en celdas Cos-7 (Figura 4, cuadrados negros). La ley de difusión tiene un valor positivo de t0 (19,47 ms ± 2 ms), lo que indica que Thy1-GFP está confinado en estructuras de nanodominio de la membrana plasmática. El tratamiento con colesterol oxidasa de las células que expresan Thy1-GFP resultó en el cambio del valor de DL t0 a 7.36 ± 1.34 ms (Figura 4, cuadrados grises). Esta observación confirma que la naturaleza del confinamiento de Thy1-GFP depende del contenido de colesterol y se asocia con nanodominios de balsa lipídica. Se ha demostrado que estas dos leyes de difusión son diferentes según la prueba estadística descrita anteriormente (véase el paso 9.1.3) en términos de valores de t0 y Deff . Además, se evaluó la concentración de colesterol celular total en células Cos-7 no tratadas versus las células tratadas con COase. Se observa una disminución pequeña, pero significativa, en el contenido de colesterol total durante el tratamiento con COase (Figura 5). Como esta enzima actúa solo sobre la reserva de colesterol accesible en la valva externa de la membrana plasmática, asumimos que la disminución observada en el colesterol se asocia solo con la membrana plasmática y resulta en la desestabilización de los nanodominios de balsa lipídica. Figura 1: Leyes de difusión de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) simuladas establecidas por FCS de variación puntual para diferentes formas de organización de membranas. (Paneles superiores) Representación esquemática de la organización de la membrana: (A) difusión libre, (B) barreras de malla y (C) confinamientos de trampa / dominio, con la trayectoria dibujada para una sola molécula (rojo). Los círculos azules denotan la intersección de la membrana y el rayo láser de la cintura ω. (Paneles inferiores) Leyes de difusión FCS representadas trazando el tiempo de difusión td en función del radio cuadrado ω2. La proyección de la ley de difusión (línea discontinua verde) intercepta el eje temporal en (A) el origen (t0 = 0) en el caso de la difusión libre; (B) en eje negativo (t0 < 0) cuando hay barreras de malla, o (C) en eje positivo (t0 > 0) cuando hay trampas y dominios (balsas lipídicas). D es el coeficiente de difusión lateral para el movimiento browniano; Deff, el coeficiente de difusión efectivo; Dmicro, el coeficiente de difusión microscópico dentro de las trampas de malla; Den, el coeficiente de difusión dentro de los dominios; Dout, el coeficiente de difusión fuera de los dominios; L, el tamaño del lado de un dominio cuadrado; y rD, el radio de un dominio circular. Esta figura ha sido modificada a partir de He y Marguet6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Vista esquemática del control de hardware svFCS. El ordenador controla todos los dispositivos a través de diferentes protocolos de comunicación: serial (microscopio, obturador externo), USB (etapa piezoeléctrica XYZ, correlacionador) y PCI (placa de adquisición). DAQ: placa de adquisición de datos, APD: fotodiodo de avalancha, SPCM: módulo de conteo de fotón único, DO: salida digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Vista esquemática de las rutas ópticas de excitación y emisión de la configuración svFCS. La configuración svFCS contiene cuatro módulos: (1) se colima la salida de un láser fibrado de 488 nm, (2) se colima una combinación de una placa de media onda y un divisor de haz polarizador establece la potencia óptica, (3) el rayo láser se enfoca en la muestra después de viajar a través de un microscopio motorizado sin lente de tubo, y (4) la fluorescencia se detecta a través de una ruta de detección similar a la confocal en un fotodiodo de avalancha acoplado a un solo módulo de conteo de fotones, que envía una señal a un correlacionador de hardware. La simplicidad le da al sistema su sensibilidad, robustez y facilidad de uso (ampliamente comentado en material complementario). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Las leyes de difusión svFCS generadas a partir del análisis de difusión de Thy1-GFP expresadas en Cos-7. Leyes de difusión svFCS de células Cos-7 sin tratamiento (NT, cuadrados negros) y después del tratamiento con colesterol oxidasa (COase, círculos grises). El inserto en el gráfico representa una prueba estadística de una diferencia significativa entre las dos leyes de difusión svFCS presentadas (según Mailfert et al.28). El valor de prueba (T) debe estar por encima del umbral establecido en 3.8 cuando ambas leyes de difusión son diferentes. Cuanto mayor es, mayor es la diferencia entre las leyes de difusión. El valor de T está codificado por colores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Comparación del contenido de colesterol total en células Cos-7. Las células Cos-7 no fueron tratadas (NT) o tratadas con 1 U/mL de colesterol oxidasa (COase) durante 1 h. Los datos representan un ejemplo de un experimento por triplicado. Se utilizó una prueba t de dos colas y sin aparear para evaluar la diferencia estadística (α = 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla de materiales: La lista de elementos ópticos necesarios para la configuración de svFCS. Material complementario: Este documento describe la creación de una configuración svFCS desde cero. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Aquí, hemos descrito la implementación del módulo svFCS en un microscopio fluorescente estándar, un poderoso enfoque experimental para descifrar la dinámica de la organización de la membrana plasmática en células vivas gracias al análisis de la ley de difusión FCS. Conceptualmente, el svFCS se basa en un principio simple: medidas de correlación de fluorescencia en el dominio del tiempo mientras se varía el tamaño del área de iluminación²³. Esta estrategia ha sido fundamental para deducir información nanoscópica a partir de mediciones microscópicas, lo que ayuda a descifrar los principales elementos fisicoquímicos que contribuyen a la organización de la membrana plasmática en estado estacionario²⁵ y a los procesos fisiológicos ^30,31,32,33. En conjunto, estos análisis svFCS demuestran inequívocamente la existencia de nanodominios dependientes de lípidos en varios tipos de células y su implicación directa en el ajuste de diferentes eventos de señalización.

Dentro de este marco, hay algunos aspectos ópticos que deben tenerse en cuenta al construir la configuración svFCS para optimizar el presupuesto de fotones y minimizar las aberraciones ópticas. Por lo tanto, recomendamos utilizar un microscopio del que se pueda extraer la lente del tubo cuando se realice la medición de svFCS. Además, un solo iris juega un papel clave en la configuración de svFCS: cambia el tamaño del haz en la abertura posterior del objetivo, variando así directamente el tamaño efectivo de la cintura (es decir, el volumen de excitación efectivo). El diámetro de la viga debe ajustarse a la pupila posterior objetivo para obtener el tamaño de cintura más pequeño³⁴. Esta opción, que ayuda a ajustar el tamaño de la cintura, garantiza la optimización del presupuesto de fotones y es fácil de implementar. Finalmente, se utiliza un número mínimo de partes ópticas a lo largo de la trayectoria de la luz; cuanto menos complejo es el sistema, menos fotones se pierden. Todas estas opciones mejoran significativamente la robustez de los experimentos svFCS.

Con respecto al protocolo en sí, se deben considerar algunos pasos críticos. Lo más importante es una alineación adecuada de las rutas ópticas que es crucial para el éxito de las mediciones de svFCS (protocolo, sección 2). Esto es fácil de verificar analizando la señal de fluorescencia de una solución Rh6G de 2 nM, que debe ser de ~ 200 kHz bajo iluminación láser de 300 μW. Todos los iris deben abrirse, y los ACF deben tener una amplitud importante (típicamente G0 ~ 1.5–2.0). Otro punto crítico se refiere a las células y su preparación para el análisis svFCS (protocolo, secciones 4-8). Su densidad debe adaptarse para que las células aisladas que se observarán estén disponibles para su análisis. Las células no adherentes deben inmovilizarse en una cubierta con cámara mediante el uso de una solución de poli-L-lisina. La señal de fluorescencia del etiquetado celular no debe ser demasiado fuerte, o dará como resultado ACF muy planos que son difíciles de ajustar, y los parámetros de ajuste están cargados con un error importante. Además, el etiquetado no homogéneo y los agregados de fluorescencia en las células hacen que las mediciones de svFCS sean extremadamente difíciles de interpretar. Finalmente, el tratamiento con colesterol oxidasa afecta la viabilidad celular, y el análisis svFCS no debe exceder una hora después del tratamiento. También es mejor registrar las fluctuaciones de fluorescencia de la membrana plasmática superior, ya que no está unida al soporte y no hay riesgo de difusión obstaculizada de las moléculas debido a las interacciones físicas con el soporte.

Ha habido suficientes avances en la técnica svFCS para su uso en diferentes enfoques debido a la diversidad de modalidades para ajustar el volumen de detección, lo que permite estudiar diversos procesos biológicos en células vivas. Una alternativa para ajustar el tamaño del volumen de excitación es utilizar un expansor de haz variable³⁵. También es posible simplemente modular el tamaño del área de iluminación registrando la señal fluorescente de la intersección de la membrana plasmática a lo largo de la dirección z³⁶. Esto se puede hacer en un microscopio confocal estándar para el cual se ha desarrollado un marco teórico para derivar la ley^de difusión ^37,38.

Aunque el método svFCS ofrece resolución espacio-temporal, que es necesaria para la caracterización de la organización lateral no homogénea de la membrana plasmática, los modos geométricos de confinamiento no son mutuamente excluyentes. Una desviación de t₀ en una dirección u otra revela exclusivamente un modo dominante de confinamiento²⁵. Además, otra limitación importante del presente método svFCS resulta del límite clásico de difracción óptica (~200 nm). Esto es incuestionablemente mayor que los dominios que confinan las moléculas dentro de la membrana plasmática celular. Por lo tanto, el análisis del confinamiento se infiere del valor t₀ , extrapolado de la ley de difusión.

Este inconveniente se ha superado mediante la implementación de métodos alternativos. Inicialmente, el uso de películas metálicas perforadas con nanoaperturas ofrecía la posibilidad de iluminar un área de membrana muy pequeña (es decir, por debajo del límite de difracción óptica de aberturas nanométricas individuales de radios que variaban entre 75 y 250 nm)³⁹. Se informó así del régimen de transición predicho a partir de la ley de difusión teórica para la organización de dominios aislados, que permitió un refinamiento del tamaño característico de las heterogeneidades de membrana nanométrica y una estimación cuantitativa del área de superficie ocupada por nanodominios dependientes de lípidos³⁹. Alternativamente, la iluminación nanométrica también se ha desarrollado utilizando microscopía óptica de barrido de campo cercano⁴⁰ o nanoantenas ópticas planas⁴¹. Más recientemente, la combinación del agotamiento de emisiones estimuladas (STED) y FCS ha proporcionado una herramienta poderosa y sensible para documentar la ley de difusión con una resolución espacial muy alta. Este STED-FCS da acceso a las características de difusión molecular a nanoescala que se producen en un corto período de tiempo, lo que permite el estudio de la organización dinámica de las sondas lipídicas en la membrana plasmática^42,43. Sin embargo, la supresión incompleta de la fluorescencia en el proceso STED desafía el análisis de las curvas de autocorrelación en FCS.

Se ha desarrollado un nuevo modelo de ajuste para superar esta dificultad, mejorando la precisión de los tiempos de difusión y las mediciones del número medio de moléculas⁴⁴. Finalmente, para la difusión molecular lenta en la membrana plasmática, el principio svFCS se puede aplicar a los datos registrados por espectroscopia de correlación de imágenes⁴⁵. Recientemente, se ha demostrado que la combinación de microscopía de fuerza atómica (AFM) con imágenes de reflexión interna total-FCS (ITIR-FCS) contribuye al refinamiento de la naturaleza del mecanismo que dificulta la difusión molecular en la membrana plasmática, especialmente cerca de la configuración de la membrana del umbral de percolación debido a una alta densidad de nanodominios⁴⁶.

En conclusión, el establecimiento de la ley de difusión por svFCS ha proporcionado la evidencia experimental para inferir la heterogeneidad local creada por las asociaciones dinámicas de lípidos colectivos y proteínas de membrana. Como afirman Wohland y sus colaboradores⁴⁶, “el análisis de la ley de difusión de FCS sigue siendo una herramienta valiosa para inferir características estructurales y organizativas por debajo del límite de resolución a partir de información dinámica”. Aún así, necesitamos desarrollar nuevos modelos para refinar la interpretación de la ley de difusión que debería permitir una mejor comprensión de la dinámica de los eventos moleculares que ocurren en la membrana plasmática.

Materials

Aligment tool	Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings	Thorlabs	SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)	Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m	RS Components	742-4315
	Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2	RS Components	885-8172
	Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz	RS Components	546-4948
	Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V	RS Components	768-5500
	Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C	RS Components	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter	RS Components	792-4079
Fluorescence filtering	535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm	AHF filter	F47-539
	Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm	AHF filter	F43-088
	496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25	AHF filter	F37-496
Hardware correlator	80 MHz Digital Correlator	Correlator.com	Flex02-12D
Laser	LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
Laser safety	High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll	Thorlabs	T743-2.0
	Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets	Thorlabs	MC-5
	Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission	Thorlabs	LG3B
Microscope	Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters	Carl Zeiss
	C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR	Carl Zeiss	421767-9971-711
	Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	Middle ring W0.8 – W0.8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
Optical path	D25.4mm Mirror, Protected Silver	Thorlabs	PF10-03-P01
	D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat	Thorlabs	AC254-060-A
	D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat	Thorlabs	AC254-035-A
	25 µm mounted pinhole	Thorlabs	P25S I
	25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm	Thorlabs	PBS201
	Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount	Thorlabs	KM100B/M
	Adjustable Prism Clamp	Thorlabs	PM3/M
	Beam block – active area 19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M
	Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture	Thorlabs	ID25/M
	Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount	Thorlabs	KM100CL
	1" Optic Holder, M4 Tap	Thorlabs	MFF101/M
	1" Stackable Lens Tube	Thorlabs	SM1L03
	Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½	Thorlabs	SM1L05
	Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2"	Thorlabs	SM1L20
	Small Optical Rails 600mm, metric	Thorlabs	RLA600/M
	Small Optical Rails 75mm, metric	Thorlabs	RLA075/M
	Small Optical Rails 150mm, metric	Thorlabs	RLA150/M
	Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1"	Thorlabs	RC1
	Rail Carrier, Perpendicular Dovetail	Thorlabs	RC3
	High Precision Translating Lens Mount for 1 inch	Thorlabs	LM1XY/M
	½ " (12mm) Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12/M
	Rail Clamps	Thorlabs	CL6
	Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)	Thorlabs	PT3/M
	Black Rubberized Fabric	Thorlabs	BK5
	Ball Driver kit/ 6 tools	Thorlabs	BD-KIT/M
	Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads	Thorlabs	AP6M4M
	Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack	Thorlabs	BA1S/M-P5
	Lens Mount for 25.4mm optic	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APC Adapter	Thorlabs	SM1FCA
	Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics	Thorlabs	KM100
	Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW	Thorlabs	S120C
	12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack	Thorlabs	PH50/M-P5
	Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm	Thorlabs	PH20/M
	12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack	Thorlabs	TR50/M-P5
	12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack	Thorlabs	TR75/M-P5
	USB Power and Energy Meter Interface	Thorlabs	PM100USB
	12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole	Thorlabs	TR30/M
	12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole	Thorlabs	TR20/M
	750 mm long Structural Rail (detection box)	Thorlabs	XE25L750/M
	350 mm long Structural Rail (detection box)	Thorlabs	XE25L350/M
	Quick Corner Cube for 25 mm Rails	Thorlabs	XE25W3
	Right-Angle Bracket for 25 mm Rails	Thorlabs	XE25A90
	Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets	Thorlabs	TB5
	Hinge for 25 mm Rail Enclosures	Thorlabs	XE25H
	Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures	Thorlabs	XE25LS
	M4 Cap Screw Kit	Thorlabs	HW-KIT1/M
	M6 Cap Screw Kit and Hardware kit	Thorlabs	HW-KIT2/M
	Table Clamp, L-Shape, 5 Pack	Thorlabs	CL5-P5
	SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm)	Thorlabs	SM1D12D
	Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD
	Honeycomb Optical Table Top, Standa	Standa	1HB10-15-12
	Optical Table support, Standa	Standa	1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning	Precision XYZ Nanopositioning	Physik Instrumente	PI P527-3.CD
	Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,	Physik Instrumente	PI E727-3.CD
Temperature chamber	Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK	Digital Pixel
	Dual Channel Microprocessor Temperature Controller	Digital Pixel	DP_MTC_2000_DUO
	Two Vibration Free Heater Modules	Digital Pixel	DP_150_VF
	PT100 Temperature Sensor	Digital Pixel	DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection	Cos7 cells	ATCC®	CRL-1651™
	8- well Lab-Tek chambers	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
	Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
	PBS buffer	Thermo Fisher Scientific	14190144
	PenStrep	Thermo Fisher Scientific	15140122
	PolyJet Transfection Reagent	SignaGen Laboratories	SL100688
Cholesterol content measurement	Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A12216
	Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	87786
	Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78420
	ROTI Nanoquant Working Solution	Roth	K880
	GloMax Discover Microplate Reader	Promega	GM3000
svFCS measurements	HBSS buffer	Thermo Fisher Scientific	14025092
	Hepes buffer	Thermo Fisher Scientific	15630080
	Cholesterol oxidase	Sigma-Aldrich	C8868
	Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	83697-1G