Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell’allungamento ciclico.
Abstract
L’uso di biomateriali riassorbibili per indurre la rigenerazione direttamente nel corpo è una strategia interessante dal punto di vista traslazionale. Tali materiali inducono una risposta infiammatoria all’impianto, che è il motore del successivo riassorbimento del materiale e della rigenerazione di nuovo tessuto. Questa strategia, nota anche come ingegneria tissutale in situ, viene perseguita per ottenere sostituzioni cardiovascolari come innesti vascolari ingegnerizzati nei tessuti. Sia il processo infiammatorio che quello rigenerativo sono determinati dai segnali biomeccanici locali sull’impalcatura (cioè stretch e shear stress). Qui, descriviamo in dettaglio l’uso di un bioreattore sviluppato su misura che consente in modo univoco il disaccoppiamento dello stress di allungamento e taglio su un’impalcatura tubolare. Ciò consente la valutazione sistematica e standardizzata della capacità infiammatoria e rigenerativa di scaffold tubolari sotto l’influenza di carichi meccanici ben controllati, che dimostriamo sulla base di un esperimento di co-coltura dinamica utilizzando macrofagi e miofibroblasti umani. I passaggi pratici chiave in questo approccio – la costruzione e l’creazione del bioreattore, la preparazione degli scaffold e la semina cellulare, l’applicazione e la manutenzione del flusso di allungamento e taglio e la raccolta dei campioni per l’analisi – sono discussi in dettaglio.
Introduction
L’ingegneria tissutale cardiovascolare (TE) viene perseguita come opzione di trattamento alternativa alle protesi cardiovascolari permanenti attualmente utilizzate (ad esempio, innesti vascolari, sostituzioni delle valvole cardiache), che non sono ottimali per grandi coorti dipazienti 1,2,3,4. Applicazioni molto ricercate includono innesti vascolari ingegnerizzati tissutale (TEVG)5,6 e valvole cardiache (TEHV)7,8. Molto spesso, le metodologie TE cardiovascolari fanno uso di biomateriali riassorbibili (naturali o sintetici) che fungono da impalcatura istruttiva per la formazione del nuovo tessuto. La formazione di nuovo tessuto può essere ingegnerata completamente in vitro, seminando l’impalcatura con cellule e coltivando in un bioreattore prima dell’impianto (TE in vitro)9,10,11,o direttamente in situ, in cui l’impalcatura sintetica viene impiantata senza pre-coltura al fine di indurre la formazione di nuovo tessuto direttamente nel corpo (in situ TE)12,13,14. Per gli approcci TE cardiovascolari sia in vitro che in situ, il successo della rigenerazione funzionale dipende prevalentemente sia dalla risposta immunitaria dell’ospite al costrutto impiantato che dal carico biomeccanico appropriato.
L’importanza del carico biomeccanico per il TE cardiovascolare è ben nota15. Nel caso di impianti cardiovascolari, le cellule che popolano l’impalcatura sono esposte a tensioni cicliche di allungamento e taglio che sorgono a seguito dell’ambiente emodinamico. Numerosi studi hanno riportato l’effetto stimolante dell’allungamento (ciclico) sulla formazione di componenti della matrice, come il collagene16,17,18,19,i glicosaminoglicani (GAG)20,e l’elastina21,22,da parte di vari tipi di cellule. Ad esempio, Huang et al. hanno dimostrato che l’allungamento biassiale ha elevato la deposizione e l’organizzazione di collagene ed elastina nei TEVG in vitro utilizzando un bioreattorevascolare 23. Mentre l’enfasi si trova in genere sull’allungamento come carico dominante, questi studi spesso fanno uso di bioreattori guidati dal flusso in cui il campione è anche esposto al flusso di taglio. Sebbene si sa relativamente poco sull’influenza isolata delle sollecitazioni di taglio sulla formazione dei tessuti e sull’infiammazione in 3D, alcuni dati sono disponibili. Ad esempio, Hinderer et al. e Eoh et al. hanno dimostrato che il flusso di taglio, oltre a una microstruttura 3D dello scaffold, era importante per la formazione di elastina matura da parte delle cellule muscolari lisce vascolari umane in un sistema modello in vitro24,25. Complessivamente, questi risultati illustrano la rilevanza sia dello stretching ciclico che dello stress da taglio per il TE cardiovascolare.
Un altro importante fattore determinante per il successo o il fallimento degli impianti TE è la risposta immunitaria dell’ospite all’innesto impiantato26. Ciò è particolarmente importante per le strategie TE in situ guidate dal materiale, che in realtà si basano sulla risposta infiammatoria acuta all’impalcatura per avviare i successivi processi di afflusso cellulare e formazione e rimodellamento del tessuto endogeno27. Il macrofago è un iniziatore critico della rigenerazione funzionale dei tessuti, che è stato dimostrato da più studi28,29,30. Analogamente alla guarigione delle ferite, la rigenerazione del tessuto è governata dalla segnalazione paracrina tra macrofagi e cellule produttrici di tessuti come fibroblasti e miofibroblasti31,32,33. Oltre a coordinare la deposizione di nuovi tessuti, i macrofagi sono coinvolti nel riassorbimento attivo del materiale estraneo dell’impalcatura34,35. Come tale, la risposta dei macrofagi in vitro a un biomateriale è stata identificata come parametro predittivo per il successo in vivo degli impianti36,37,38.
La risposta dei macrofagi a un’impalcatura impiantata dipende dalle caratteristiche di progettazione dell’impalcatura come la composizione del materiale e la microstruttura35,39,40. Oltre alle proprietà dell’impalcatura, anche la risposta dei macrofagi a un’impalcatura e la loro diafonia con i miofibroblasti è influenzata dai carichi emodinamici. Ad esempio, l’allungamento ciclico ha dimostrato di essere un importante modulatore del fenotipo macrofagico41,42,43,44 e della secrezione di citochine43,44,45,46 in scaffold elettrofilati 3D. Utilizzando un sistema di co-coltura di macrofagi e cellule muscolari lisce vascolari, Battiston et al. hanno dimostrato che la presenza di macrofagi ha portato ad un aumento dei livelli di elastina e GAG e che livelli moderati di allungamento ciclico (1,07-1,10) stimolano la deposizione di collagene I ed elastina47. In lavori precedenti, abbiamo dimostrato che lo stress da taglio è un determinante importante per il reclutamento di monociti negli scaffold elettrofili 3D48,49e che sia lo stress di taglio che l’allungamento ciclico influenzano la segnalazione paracrina tra monociti umani e cellule stromali mesenchimali50. Fahy et al. hanno dimostrato che il flusso di taglio ha aumentato la secrezione di citochine pro-infiammatorie da parte di monociti umani51.
Nel loro insieme, le prove di cui sopra mostrano che un’adeguata comprensione e controllo dei carichi emodinamici è cruciale per il TE cardiovascolare e che è importante considerare la risposta infiammatoria per raggiungere questo obiettivo. Numerosi bioreattori sono stati descritti in precedenza per la coltura in vitro52,53,54,55,56,57,58 o ex vivo59,60,61 di tessuti cardiovascolari. Tuttavia, tutti questi sistemi sono progettati per imitare il più possibile le condizioni di carico emodinamico fisiologico. Mentre questo è molto prezioso allo scopo di creare tessuti cardiovascolari in vitro o mantenere colture ex vivo, tali sistemi non consentono studi sistematici sugli effetti individuali dei singoli segnali. Questo perché l’applicazione sia dello stretching ciclico che dello stress di taglio in questi bioreattori è guidata dallo stesso flusso pressurizzato, che li collega intrinsecamente. Mentre i microsistemi che consentono un’accurata manipolazione meccanica multi-cue sono stati descritti per substrati2D 62 o configurazioni idrogel 3D63,64, tali configurazioni non consentono l’incorporazione di scaffold di biomateriali 3D elastomerici.
Qui presentiamo l’applicazione di un sistema di bioreattore tubolare che consente in modo univoco il disaccoppiamento dello stress di taglio e dell’allungamento ciclico e aiuta a studiare meccanicamente i loro effetti individuali e combinati. Questo sistema consente di testare un’ampia varietà di innesti vascolari di ingegneria tissutale (ad esempio, origine sintetica o naturale, diverse micro-architetture, varie porosità). Per disaccoppiare efficacemente l’applicazione dello sforzo di taglio e dell’allungamento, i concetti chiave utilizzati dal bioreattore sono (1) separazione del controllo dello sforzo di taglio e dello stiramento utilizzando sistemi di pompaggio distinti e (2) stimolazione degli scaffold in modo “inside-out” con dimensioni guidate computazionalmente. Il flusso viene applicato sulla superficie esterna dell’impalcatura tubolare attraverso l’uso di una pompa di flusso, mentre l’allungamento circonferenziale dell’impalcatura è indotto dall’espansione di un tubo di silicone su cui è montato l’impalcatura attraverso l’uso di una pompa di deformazione separata. Le dimensioni del tubo di silicone e del tubo di vetro che contiene il costrutto sono accuratamente scelte e convalidate utilizzando simulazioni fluidodinamiche computazionali, per garantire che lo sforzo di taglio sull’impalcatura (dovuto al flusso) e l’allungamento circonferenziale (dovuto all’espansione del tubo) non si influenzino in modo significativo l’un l’altro. Questo design inside-out ha diverse motivazioni pratiche. Se l’allungamento viene applicato dalla pressione del fluido luminale (simile al carico fisiologico), richiede intrinsecamente che il design del campione sia privo di perdite. Inoltre, la pressione necessaria per allungare il campione sarebbe completamente determinata dalla rigidità del campione, che può variare tra i campioni e all’interno di un campione nel tempo, rendendo difficile il controllo dell’allungamento. Questo bioreattore monta l’innesto di ingegneria tissutale attorno a un tubo di silicone e consente l’applicazione dello stress di taglio della parete (WSS) sulla parete esterna dell’innesto e pressurizza l’innesto dall’interno. In questo modo, è possibile garantire condizioni di carico uguali tra i campioni e all’interno dei campioni nel tempo e, inoltre, i campioni possono essere permeabili, come è comune per gli scaffold vascolari porosi19. Questo bioreattore inside-out è specificamente destinato a studi sistematici sugli effetti del taglio e / o dell’allungamento, piuttosto che all’ingegneria di un vaso sanguigno nativo in vitro, per il quale le tradizionali configurazioni del bioreattore vascolare sono più adatte. Vedere la Figura 1A–B per i disegni di progettazione del bioreattore e la corrispondente Tabella 1 per una descrizione funzionale e una logica alla base dei componenti principali del bioreattore.
L’uso del bioreattore è dimostrato sulla base di una serie di recenti studi del nostro gruppo in cui abbiamo studiato le influenze individuali e combinate dello stress da taglio e dell’allungamento ciclico sull’infiammazione e sulla formazione dei tessuti in scaffold elettrofilari riassorbibili per tessuto cardiovascolare in situ19,43,44. A tal fine, abbiamo utilizzato macrofagi e miofibroblasti umani in mono- o in co-coltura per simulare le varie fasi della cascata rigenerativa in situ. Abbiamo dimostrato che la secrezione di citochine da parte dei macrofagi umani è distintamente influenzata sia dallo stretching ciclico che dallo stress di taglio, influenzando la deposizione e l’organizzazione della matrice da parte dei miofibroblasti umani in questi scaffold, sia tramite segnalazione paracrina che contatto diretto19,43,44. In particolare, questi studi hanno rivelato che nel caso di applicazione combinata di sforzo di taglio e stretching, gli effetti sulla formazione e l’infiammazione dei tessuti sono dominati da uno dei due carichi, oppure ci sono effetti sinergici di entrambi i carichi. Questi risultati illustrano l’importanza del disaccoppiamento di entrambi i carichi per ottenere una migliore comprensione del contributo dell’ambiente meccanico sui processi TE. Questa comprensione può essere applicata per ottimizzare sistematicamente i parametri di progettazione dell’impalcatura nei regimi di carico emodinamico pertinenti. Inoltre, i dati meccanicistici provenienti da tali ambienti ben controllati possono servire come input per i modelli numerici che sono in fase di sviluppo per prevedere il decorso del rimodellamento tissutale in situ, come recentemente riportato per i TEVG65 o TEHV66, per migliorare ulteriormente la capacità predittiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il bioreattore qui descritto consente la valutazione sistematica dei contributi degli effetti individuali e combinati dello sforzo di taglio e dell’allungamento ciclico sull’infiammazione e sulla rigenerazione dei tessuti negli scaffold tubulari riassorbibili. Questo approccio consente anche di eseguire una grande varietà di analisi su costrutti vascolari, come esemplificato nella sezione dei risultati rappresentativi. Questi risultati mostrano l’impatto distintivo dei diversi regimi di carico emodinamico (cioè diverse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è sostenuto finanziariamente da ZonMw come parte del programma LSH 2Treat (436001003) e dalla Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. riconosce il sostegno del Consiglio europeo della ricerca (851960). Riconosciamo con gratitudine il programma di gravitazione “Materials Driven Regeneration”, finanziato dall’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (024.003.013).
Materials
| advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) | Gibco | 12491-015 | cell culture medium for fibroblasts |
| Aqua Stabil | Julabo | 8940012 | prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | to spin down cells and conditioned medium |
| Clamp scissor – "kelly forceps" | Almedic | P-422 | clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7) |
| CO2 cell culture incubators | Sanyo | MCO-170AIC-PE | for cell culturing |
| Compressed air reservoir | Festo | CRVZS-5 | smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up |
| Custom Matlab script to calculate the maximum stretches | Matlab | R2017. The Mathworks, Natick, MA | calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold |
| Data acquisition board | National Instruments | BNC-2090 | data processing in between amplifier system and computer |
| Ethanol | VWR | VWRK4096-9005 | to keep sterile working conditions |
| Fetal bovine calf serum (FBS) | Greiner | 758087 | cell culture medium supplement; serum-supplement |
| Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7) |
| Glass Pasteur pipet | Assistant | HE40567002 | apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1) |
| Glass tubes of the flow culture chamber | Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology | n.a. | part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up |
| High speed camera | MotionScope | M-5 | to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles) |
| High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens | Nikon | JAA616AB | to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles) |
| Hose clip | ibidi GmbH | 10821 | block medium flow (autoclave at step 1, step 7) |
| Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7) |
| Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads | ibidi GmbH | 10902 | set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied. |
| Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) | Swann Morton | 0301; 0933 | to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material |
| LabVIEW Software | National Instruments | version 2018 | to control the stretch applied to the scaffolds |
| Laminar flow biosafety cabinet with UV light | Labconco | 302310001 | to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving |
| Large and small petri dishes | Greiner | 664-160 | for sterile working conditions |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) | Sigma | A8960 | cell culture medium supplement, important for collagen production |
| LED light cold source KL2500 | Zeiss | Schott AG | to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch |
| Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps | ibidi GmbH | various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) | to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7) |
| Measuring amplifier (PICAS) | PEEKEL instruments B.V. | n.a. | to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView |
| Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders | ibidi GmbH | 10974 | medium reservoir (autoclave at step 1, step 7) |
| Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter | Rubber BV | 1805 | to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing |
| Motion Studio Software | Idtvision | 2.15.00 | to make the high speed time lapse images for stretch monitoring |
| Needle (19G) | BD Microlance | 301700 | together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles |
| Needle driver | Adson | 2429218 | to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7) |
| Paper tissues | Kleenex | 38044001 | for cleaning of the equipment with 70% ethanol |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | quick fix if leakage occurs |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Lonza | DE17-602E | cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-100TAB | for storage and washing steps (autoclave at step 1) |
| Plastic containers (60 mL) with red screw caps | Greiner | 206202 | to prepare the fibrinogen solution |
| Pneumatic cylinder | Festo | AEVC-20-10-I-P | to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7) |
| Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) | SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands | n.a. | produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details |
| Pressure conduit without holes (for static control) | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7) |
| Pressure sensor and transducer | BD | TC-XX and P 10 EZ | the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure |
| Proportional air pressure control valve and pressure sensor | Festo | MPPES-3-1/8-2-010, 159596 | provides compressed air to the pneumatic actuated pump |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) | Gibco | A1049101 | cell culture medium for monocyte/macrophage |
| Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | multiple applications (autoclave at step 1) |
| Sodium dodecyl sulfate solution 20% | Sigma | 5030 | Used to clean materials, at a concentration of 0.1%. |
| Silicone O-rings | Technirub | 1250S | to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7) |
| Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) | Rubber BV | 1805 | to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1) |
| Sterile tube (15 mL) | Falcon | 352095 | multiple applications |
| Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle | Ethicon, Johnson&Johnson | EH7404H | Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length) |
| Syringe (24 mL) | B. Braun Melsungen AG | 2057932 | to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber |
| Syringe filter (0.2 µm) | Satorius | 17597-K | to filter the fibrinogen solution |
| T150 cell culture flask with filter cap | Nunc | 178983 | to degas culture medium |
| T75 Cell culture flask with filter cap | Nunc | 156499 | to culture static control samples |
| Teflon bellow | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7) |
| Tray (stainless steel) | PolarWare | 15-248 | for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use) |
| Tweezers | Wironit | 4910 | sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7) |
| Ultrapure water | Stakpure | Omniapure UV 18200002 | to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1) |
| UV light | Philips | TUV 30W/G30 T8 | for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding |
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