Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Summary

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Abstract

L’utilisation de biomatériaux résorbables pour induire la régénération directement dans le corps est une stratégie attrayante d’un point de vue translationnel. Ces matériaux induisent une réponse inflammatoire lors de l’implantation, qui est le moteur de la résorption ultérieure du matériau et de la régénération de nouveaux tissus. Cette stratégie, également connue sous le nom d’ingénierie tissulaire in situ, est poursuivie pour obtenir des remplacements cardiovasculaires tels que des greffes vasculaires modifiées par des tissus. Les processus inflammatoires et régénératifs sont déterminés par les signaux biomécaniques locaux sur l’échafaudage (c.-à-d. contrainte d’étirement et de cisaillement). Ici, nous décrivons en détail l’utilisation d’un bioréacteur développé sur mesure qui permet de manière unique le découplage de la contrainte d’étirement et de cisaillement sur un échafaudage tubulaire. Cela permet l’évaluation systématique et standardisée de la capacité inflammatoire et régénératrice des échafaudages tubulaires sous l’influence de charges mécaniques bien contrôlées, que nous démontrons sur la base d’une expérience de co-culture dynamique utilisant des macrophages et des myofibroblastes humains. Les principales étapes pratiques de cette approche – la construction et la mise en place du bioréacteur, la préparation des échafaudages et de l’ensemencement des cellules, l’application et le maintien de l’écoulement d’étirement et de cisaillement, et la récolte d’échantillons pour analyse – sont discutées en détail.

Introduction

L’ingénierie tissulaire cardiovasculaire (TE) est poursuivie comme une option de traitement alternative aux prothèses cardiovasculaires permanentes actuellement utilisées (par exemple, greffes vasculaires, remplacements de valves cardiaques), qui sont sous-optimales pour de grandes cohortes de patients^1,2,3,4. Les applications très recherchées comprennent les greffes vasculaires d’ingénierie tissulaire (TEVG)^5,6 et les valves cardiaques (TEHV)^7,

Protocol

Dans les études décrites dans ce protocole, des macrophages humains primaires isolés des manteaux bouffants du sang périphérique et des myofibroblastes humains isolés de la veine saphène après une chirurgie de pontage coronaire ont été utilisés⁴⁴. Les manteaux bouffants ont été obtenus auprès de volontaires en bonne santé et anonymes qui ont fourni un consentement éclairé écrit, qui a été approuvé par le Comité d’éthique médicale de l’établissement de recherche Sanquin. L’utilisation de cellules de vena saphena humaines (HVSC) était conforme au « Code d’utilisation secondaire appropriée des tissus humains » développé par la Fédération des socié....

Results

Ce bioréacteur a été développé pour étudier les effets individuels et combinés du stress de cisaillement et de l’étirement cyclique sur la croissance et le remodelage des tissus vasculaires dans les échafaudages de biomatériaux 3D. La conception du bioréacteur permet de cultiver jusqu’à huit constructions vasculaires dans diverses conditions de charge(Figure 1A). Les constructions vasculaires sont positionnées dans une chambre de culture en flux(Figure 1B)dans l.......

Discussion

Le bioréacteur décrit ici permet l’évaluation systématique des contributions de l’individu et des effets combinés de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique sur l’inflammation et la régénération tissulaire dans les échafaudages tubulaires résorbables. Cette approche permet également d’effectuer une grande variété d’analyses sur des constructions vasculaires, comme l’illustre la section des résultats représentatifs. Ces résultats montrent l’impact distinctif des différents régimes de charge hémodynamique .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' avancé s modifié EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	milieu de culture cellulaire pour fibroblastes
Aqua Stabil	Julabo	8940012	empêcher la croissance de micro-organismes dans le bioréacteur-réservoir hydraulique
Fibrinogène bovin	Sigma	F8630	pour préparer le gel de fibrinogène pour ensemencer les cellules sur l’échafaudage électrofilé
Thrombine bovine	Sigma	T4648	pour préparer le gel de fibrinogène à ensemencer les cellules sur l’échafaudage électrofilé
Centrifugeuse	Eppendorf	5804	pour faire tourner les cellules et le milieu conditionné
Ciseaux à pince - « pince kelly"Almedic		P-422	clamp le tube en silicone et appliquer un pré-étirement sur l’échafaudage afin que l’échafaudage puisse être suturé dans le sillon gravé (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Incubateurs de culture cellulaire CO2	Sanyo	MCO-170AIC-PE	pour la culture en cellules
Réservoir d’air comprimé	Festo	CRVZS-5	Lissage des fluctuations de pression de l’air et création de délais pour l’accumulation de pression
Script Matlab personnalisé pour calculer les étirements maximaux	Matlab	R2017. Les Mathworks, Natick, MA	calculent le diamètre extérieur minimum et maximum de l’échafaudage électrofilé Carte d’acquisition de
données	National Instruments	BNC-2090	traitement des données entre le système d’amplification et l’ordinateur
Éthanol	VWR	VWRK4096-9005	pour maintenir des conditions de travail stériles
Sérum de veau bovin fœtal (FBS)	Greiner	758087	supplément de milieu de culture cellulaire ;
compartiments de la chambre de culture à flux, composés d’un conduit de pression avec des rainures gravées et de petits trous pour appliquer une pression sur un tube en silicone, un filetage de vis, un cône de nez, un compartiment supérieur avec entrée d’écoulement et une sortie d’écoulement du compartiment inférieur, douille d’adaptation	Fabriqué sur mesure, Département de génie biomédical, Université de technologie d’Eindhoven	n.a.compartiments	de la chambre de culture en flux (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Pipette Pasteur en verre	Assistant	HE40567002	appliquer le vide sur un échafaudage électrofilé (autoclave à l’étape 1)
Tubes en verre de la chambre de culture à flux	Custon fabriqué, Equipement & Centre de prototypage, Université de technologie d’Eindhoven	n.a.partie	de la chambre de culture en flux (nettoyer et stocker dans de l’éthanol à 70 %, aux étapes 1 et 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	supplément d’acides aminés moyen de culture cellulaire, minimise l’accumulation d’ammoniac
Caméra haute vitesse	MotionScope	M-5	pour surveiller l’étirement pendant la culture ; des photographies en accéléré des échafaudages sont capturées à une fréquence de 30 Hz pendant 6 secondes (c’est-à-dire 3 cycles d’étirement)
Objectif de caméra haute vitesse - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - objectif	Nikon	JAA616AB	pour surveiller l’étirement pendant la culture ; des photographies en accéléré des échafaudages sont capturées à une fréquence de 30 Hz pendant 6 secondes (c’est-à-dire 3 cycles d’étirement)
Clip de tuyau	ibidi GmbH	10821	bloc à débit moyen (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Réservoir hydraulique avec 8 filetages pour 8 chambres de culture à flux	Fabrication sur mesure, Département de génie biomédical, Université de technologie d’Eindhoven	n.a.	pour appliquer une pression sur les constructions montées en silicone (nettoyer l’extérieur avec un mouchoir en papier avec 70 % d’éthanol, rincer le réservoir avec 70 % d’éthanol suivi d’une demi-eau, aux étapes 1 et 7)
Système de pompe Ibidi (8x) avec pompe ibidi, logiciel PumpControl, unité fluidique, kit de perfusion (tube moyen), tube à pression d’air, flacons de séchage avec billes de silice orange	ibidi GmbH	10902	configuré pour contrôler le débit dans les chambres de culture en flux. Note 1 : les pompes ibidi ont été modifiées par le fabricant pour permettre une capacité de 200 mbar. Remarque 2 : peut être remplacé par un système de pompe d’un autre fabricant, à condition que les mêmes régimes d’écoulement puissent être appliqués.
Couteaux (n° 10 lames stériles, emballage individuel) et manche de scalpel (en acier inoxydable, emballé individuellement)	Swann Morton	0301 ; 0933	pour couper le tube en silicone à la bonne taille pour l’échafaudage et pour couper le matériau de suture
Logiciel LabVIEW	National Instruments	version 2018	pour contrôler l’étirement appliqué aux échafaudages
Armoire de biosécurité à flux laminaire avec lumière UV	Labconco	302310001	pour garantir des conditions de travail stériles. L’UV est utilisé pour décontaminer tout ce qui ne peut pas être autoclavé, ou touché après l’autoclave
Grandes et petites boîtes de Pétri	Greiner	664-160	pour des conditions de travail stériles
Acide L-ascorbique 2-phosphate (vitamine C)	Sigma	A8960	complément de milieu de culture cellulaire, important pour la production de collagène
Source froide de lumière LED KL2500	Zeiss	Schott AG	pour faciliter la visualisation du laps de temps des échafaudages lors de la surveillance de l’étirement
Luer (femelle et mâle) serrures et connecteurs, capuchons Luer blancs	ibidi GmbH	divers, voir (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	pour fermer ou connecter des parties du bioréacteur et de la pompe ibidi (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Amplificateur de mesure (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	pour amplifier le signal du capteur de pression et de la rétroaction vers le
réservoir LabView Medium (grandes seringues 60 mL) et les supports de réservoir	ibidi GmbH	10974	réservoir moyen (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Tube moyen avec un diamètre extérieur de 4,25 mm et un diamètre intérieur de 1 mm	Rubber BV	1805	Pour permettre un débit plus important, le tube IBIDI Medium de plus grand diamètre est utilisé. Remarque : la partie du tube moyen guidée à travers les vannes de l’unité fluidique est la même que celle du tube moyen ibidi par défaut
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	pour réaliser les images en accéléré à grande vitesse pour la surveillance de l’étirement
Aiguille (19G)	BD Microlance	301700	avec un tube mince et flexible utilisé pour remplir le réservoir hydraulique avec de l’eau ultrapure sans ajouter de bulles d’air
Tournevis	à aiguilleAdson	2429218	pour manipuler l’aiguille de la suture en nylon à travers le tube en silicone (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Mouchoirs en papier	Kleenex	38044001	pour le nettoyage de l’équipement avec de l’éthanol à 70 %
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	solution rapide en cas de fuite
Pénicilline/streptomycine (P/S)	Lonza	DE17-602E	supplément de milieu de culture cellulaire ; prévenir les bactéries contamination
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	pour les étapes de stockage et de lavage (autoclave à l’étape 1)
Récipients en plastique (60 mL) avec bouchons à vis rouges	Greiner	206202	pour préparer la solution de fibrinogène
Cylindre pneumatique	Festo	AEVC-20-10-I-P	pour actionner le soufflet en téflon (nettoyer avec un mouchoir en papier contenant 70 % d’éthanol aux étapes 1 et 7)
Échafaudages tubulaires en polycaprolactone bisurea (PCL-BU) (3 mm de diamètre intérieur, 200 & micro ; m d’épaisseur de paroi, longueur de 20 mm)	SyMO-Chem, Eindhoven, Pays-Bas	n.a.	produit par électrofilage à partir de solutions polymères à 15 % (p/p) de chloroforme (Sigma ; 372978). Voir Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) pour plus de détails
Conduit de pression sans trous (pour le contrôle statique)	sur mesure, Département de génie biomédical, Université de technologie d’Eindhoven	n.a.pour	monter des tubes électrofilés sur des tubes en silicone (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Capteur de pression et transducteur	BD	TC-XX et P 10 EZ	la pression d’air allant à la pompe à commande pneumatique est augmentée jusqu’à ce qu’elle atteigne la pression de consigne
Soupape de régulation de pression d’air proportionnelle et capteur de pression	Festo MPPES-3-1	/8-2-010, 159596	fournit de l’air comprimé à la pompe à commande pneumatique
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	milieu de culture cellulaire pour monocytes/macrophages
Tubes Eppendorf Safe lock (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	de multiples applications (autoclave à l’étape 1)
Solution de dodécylsulfate de sodium 20 %	Sigma	5030	Utilisé pour nettoyer les matériaux, à une concentration de 0,1 %.  ;   ;
Joints toriques en silicone	Technirub	1250S	pour éviter les fuites (autoclave à l’étape 1, étape 7)
Tube en silicone (diamètre extérieur de 2,8 mm, épaisseur de paroi de 400 um)	Caoutchouc BV	1805	pour monter les tubes électrofilés sur les conduits de pression (autoclave à l’étape 1)
Tube stérile (15 mL)	Falcon	352095	applications multiples
Suture, 5-0 prolene avec aiguille à pointe conique pré-attachée	Ethicon, Johnson& Johnson	EH7404H	Prolene fil de suture 5-0 (longueur 75 cm, aiguille à pointe conique TF, 1/2 cercle, longueur d’aiguille 13 mm)
Seringue (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	d’ajouter l’eau ou le fluide ultra-pur dans le réservoir hydraulique ou la chambre de culture à flux
Filtre à seringue (0,2 µ ; m)	Satorius	17597-K	pour filtrer la solution de fibrinogène Fibrinogène
T150 Fiole de culture cellulaire avec bouchon filtrant	Nunc	178983	pour dégazer le milieu de culture
T75 Fiole de culture cellulaire avec bouchon filtrant	Nunc	156499	pour cultiver des échantillons de contrôle statiques
Soufflet en téflon	Fabriqué sur mesure, Département de génie biomédical, Université de technologie d’Eindhoven	n.a.	pour charger le réservoir hydraulique (nettoyer l’extérieur avec un mouchoir en papier avec 70 % d’éthanol aux étapes 1 et 7)
Plateau (acier inoxydable)	PolarWare	15-248	pour faciliter le transport des chambres de culture fluidique et du bioréacteur de l’incubateur à l’armoire à flux laminaire et retour (nettoyer avec un mouchoir en papier avec 70 % d’éthanol avant et après utilisation)
Pince à épiler	Wironit	4910	manipulation stérile des pièces individuelles (autoclave aux étapes 1 et 7)
Eau ultrapure	Stakpure	Omniapure UV 18200002	pour corriger l’évaporation du milieu, mélangée à de l’aqua stabil mélangé et utilisé comme fluide hydraulique. (eau ultra-pure en autoclave à l’étape 1)
Lumière UV	Philips	TUV 30W/G30 T8	pour la décontamination des greffons et des pièces de bioréacteur avant l’ensemencement