Vi beskriver en systematisk arbejdsgang for at undersøge TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT ved at studere det protein- og genekspression, der er involveret i denne signalvej. Metoderne omfatter vestlig blotting, en luciferase reporter assay, qPCR, og immunofluorescens farvning.
Transformering af vækstfaktor-β (TGF-β) er en udskilles multifunktionel faktor, der spiller en central rolle i intercellulær kommunikation. Perturbationer af TGF-β signalering kan føre til brystkræft. TGF-β fremkalder dens virkninger på spredning og differentiering via specifik celleoverflade TGF-β type I- og type II-receptorer (dvs. TβRI og TβRII), der indeholder et iboende serin/threonine kinase-domæne. Ved TGF-β-induceret heteromerisk kompleksdannelse fremkalder aktiveret TβRI intracellulær signalering ved fosforylerende SMAD2 og SMAD3. Disse aktiverede SMAD’er danner heteromeriske komplekser med SMAD4 for at regulere specifikke målgener, herunder plasminogen aktiveringshæmmer 1 (PAI-1, kodet af SERPINE1-genet). Induktionen af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) tillader epitelkræftceller på det primære sted eller under kolonisering på fjerne steder for at få en invasiv fænotype og drive tumorprogression. TGF-β fungerer som en potent inducer af brystkræft invasion ved at køre EMT. Her beskriver vi systematiske metoder til at undersøge TGF-β signalering og EMT svar ved hjælp af premalignant menneskelige MCF10A-RAS (M2) celler og mus NMuMG epitelceller som eksempler. Vi beskriver metoder til at bestemme TGF-β-induceret SMAD2-fosforylering ved vestlig blotting, SMAD3/SMAD4-afhængig transskriptionsaktivitet ved hjælp af luciferase reporteraktivitet og SERPINE1-målgenudtryk ved kvantitativ kædereaktion i realtid polymerase (qRT-PCR). Desuden beskrives metoder til at undersøge TGF-β-induceret EMT ved at måle ændringer i morfologi, epitel og mesenchymal markørudtryk, filamentøs actin farvning og immunfluorescens farvning af E-cadherin. To selektive små molekyle TGF-β receptor kinase hæmmere, GW788388 og SB431542, blev brugt til at blokere TGF-β-induceret SMAD2 fosforylering, målgener og ændringer i EMT markør udtryk. Desuden beskriver vi transdifferentiation af mesenchymal bryst Py2T murine epitel tumorceller i adipocytter. Metoder til at undersøge TGF-β-induceret signalering og EMT i brystkræft kan bidrage til nye terapeutiske tilgange til brystkræft.
Cytokintransformationen vækstfaktor-β (TGF-β) er prototypen på en stor gruppe strukturelt og funktionelt relaterede regulatoriske polypeptider, herunder TGF-βs (dvs. TGF-β1, -β2 og -β3), knoglemorfogene proteiner (BMP’er) og aktiviteter1,2. Disse cytokiner spiller alle vigtige roller i embryonal udvikling og i vedligeholdelsen af væv og organhomøostase3. Forkert regulering af TGF-β kan føre til en lang række sygdomme, herunder kræft4,5. TGF-β spiller en kompleks, dobbelt rolle i kræft progression: i normale og premalignant epitelceller, TGF-β opfører sig som en tumor-suppressor ved at hæmme spredning og fremkalde apoptose6,7; men på det sene stadium af tumor progression, når cytostatiske reaktioner blokeres af aktivering af onkogener eller tab af tumor suppressor gener, TGF-β fungerer som en tumorforstærker ved at fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i kræftceller, hvilket muliggør kræftcelleinvasion og metastaser, der virker på celler i tumormikromiljøet og stimulerer angiogenese og immununddragelse8,9,10.
TGF-β udskilles som et inaktivt prækursormolekyle, der indeholder den modne carboxyterminal TGF-β og latenstidsrelateret peptid (LAP)11. Dette lille kompleks kan kovalent bindes af latent TGF-β-bindende protein (LTBP)12. Frigivelsen af modne TGF-β kan medieres ved hjælp af specifikke proteaser, der kløver LAP eller ved mekanisk træk af LAP i en integrinafhængig proces13,14. Ud over LTBP, Glycoprotein A gentagelser fremherskende (GARP) er stærkt udtrykt på overfladen af regulerende T-celler (Tregs) og spiller en lignende rolle som LTBP i reguleringen af aktiveringen af TGF-β15,16. GARP binder sig direkte til latent TGF-β gennem disulfidforbindelse og ikke-valent tilknytning. Aktiveringen af TGF-β fra GARP/TGF-β-komplekset kræver integrins17. Modne TGF-β binder sig til TGF-β β serin β/threonine kinasereceptorer, dvs. Bindingen af TGF-β til TβRII fremmer ansættelsen af TβRI og dannelsen af et heteromerisk kompleks. Derefter fosforeres TβRI af TβRII kinase på serin- og threoninerester i et kort glycin- og serinrigt (GS) motiv, hvilket resulterer i dets aktivering19,20. Ved aktiveringen rekrutterer og fosforiske TβRI sine substrater: de to receptorspecifikke SMAD’er (R-SMADs), der omfatter SMAD2 og SMAD3 (Figur 1). R-SMADs deler en lignende overordnet struktur med to såkaldte Mad homologi domæner, MH1 og MH2, der er adskilt af en proline-rige linker region (Figur 2). DNA-bindingsmotivet inden for SMAD3’s MH1-domæne bevares ikke mellem SMAD2 og SMAD3, og SMAD2 kan ikke binde DNA direkte på grund af to indsættelser i mh1-domænet (exon 3 og L1). SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering af SSXS-motivet i deres C-termini (Figur 2). Fosforinerede SMAD2/3 danner heteromeriske komplekser med en fælles SMAD-mægler, SMAD4, som omfordeler til kernen for at modulere transskriptionen af målgener (Figur 1)7,21. Denne kanoniske SMAD-signalvej er præcist reguleret og genererer specifikke cellulære og vævsresponser såsom regulering af celle skæbne og tumorcellemetastase og invasion22. Ud over TGF-β-SMAD-signalering kan ikke-SMAD-signalveje også aktiveres direkte af receptorer for at regulere downstream-cellulære reaktioner23.
Under tumor progression, aktivering af TGF-β-induceret SMAD-afhængige og SMAD-uafhængige veje er nødvendige for induktion af EMT. EMT er en reversibel proces, hvor tumorceller dedifferentierer fra en epitel fænotype, som er forbundet med tab af cellecellekontakter og nedsat apikale-basal polaritet, til en mesenchymal fænotype med forbedret motilitet og invasionsevne24. EMT er kendetegnet ved øget ekspression af mesenchymale markørproteiner, herunder N-cadherin, vimentin, Zeb2 og Snail1/2, og den samtidige nedregulering af epitelmarkører, såsom E-cadherin og β-catenin (Figur 3)25. Overgangen fra en epitel til en mesenchymal tilstand er imidlertid ofte ufuldstændig, og celler får blandede epitel- og mesenchymale (E/M) egenskaber. I et nyligt dokument fra Den Internationale EMT-sammenslutning blev det foreslået at beskrive processen med celler, der gennemgår mellemliggende E/M-fænotypiske tilstande, som epitel-mesenchymal plasticitet (EMP)26. Denne plasticitet refererer til delvis EMT, en hybrid E/M-status, en metastable EMT-tilstand, et EMT-kontinuum og et EMT-spektrum26. Under EMT, tumorceller få kræft stamceller (CSC) egenskaber og blive mere resistente over for løsrivelse-induceret apoptose27. Mens EMT er ansvarlig for erhvervelsen af en invasiv fænotype i primære tumorceller og driver kræft progression, derimod, mesenchymal-epitel overgang (MET) har vist sig at spille en vigtig rolle i udvæksten af formidlede tumorceller på fjerne metastatiske steder28,29. En nylig undersøgelse viste, at EMT-afledte brystkræftceller kan transdifferentieres til adipocytter, som kan give mulighed for at hæmme metastaser og overvinde terapiresistens i tumorceller og tilbagefald kræft30. På grund af den vigtige rolle, som TGF-β signalering spiller i aktiveringen af EMT i bryst carcinogenese, vi præsenterer detaljerede protokoller for vestlig blotting, en luciferase transskriptionel reporter assay, kvantitative real-time-polymerase kædereaktion (qRT-PCR), og immunofluorescens til undersøgelse af TGF-β signalering, TGF-β-induceret EMT, og transdifferentiering af EMT-afledte murine bryst epitel tumorceller i adipocytter. Disse teknikker er de mest anvendte analytiske værktøjer inden for cellebiologi. qRT-PCR bruges til at registrere, karakterisere og kvantificere mRNA-udtryksniveauer på en kvantitativ måde. Sammenlignet med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknik, kan den omvendte transskription (RT)-PCR bruges til at bestemme mRNA-udtryk på en semi-kvantitativ måde31,32. Vestlig blotting anvendes til at undersøge specifikke proteinniveauer i en given celle lysatprøve med fordele af følsomhed og specificitet, på en semi-kvantitativ måde. Således præsenterer vi en systematisk arbejdsgang til at analysere ændringer fra genekspression til proteinudtryk for at hjælpe med at undersøge TGF-β signalering, der også kan anvendes på andre signalveje.
TGF-β/SMAD signalering spiller en central rolle i brystkræft progression, da det kan fremme brystkræft celle invasivitet og metastaser ved at fremkalde EMT7. Her beskrev vi en logisk arbejdsgang for at undersøge TGF-β-initieret signalering fra receptor-induceret SMAD-aktivering til SMAD-medierede transskriptionelle og biologiske reaktioner. Vi startede med at beskrive analysen af SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-induceret SMAD3-afhængige transskriptionelle reaktioner og EMT-markørudtryk på både gen- og proteinniveauer for at analysere TGF-β / SMAD-signalrespons og undersøgte endelig TGF-β-induceret EMT. Vi brugte CAGA12-luciferase transskriptionel reporter, der indeholder CAGA bokse stammer fra PAI-1 initiativtageren, til at overvåge aktiviteten af TGF-β/SMAD signalering vej35. Denne reporterkonstruktion kræver SMAD3 og SMAD4 til aktivering. Tidligere undersøgelser har vist , at knockdown af SMAD4 svækkede TGF-β-induceret CAGA12-luciferase aktivitet37. Ud over reporter assay, bestemmelse af fosforylering status af endogene SMADs, herunder SMAD2 og SMAD3, er en anden måde at undersøge TGF-β signalering svar. Faktisk andre medlemmer af TGF-β familie, såsom vækst og differentiering faktor (GDF)-8/myostatin og GDF-9, også transduce signaler via SMAD2 / 3 proteiner ved at engagere TβRI42,43,44. Ud over CAGA12-luciferase reporter, flere lignende journalister er blevet brugt til at opdage aktiveringen af TGF-β signalering. For eksempel kan en transskriptionel (SBE)4-Lux reporter med responselementer afledt af JunB-initiativtageren effektivt induceres af TGF-β, aktiviteter og BMP’er45.
Vestlig blotting og qPCR blev brugt til at analysere TGF-β-induceret EMT, som er klassiske metoder til at undersøge udtrykket af epitelmarkører (dvs. E-cadherin) og mesenchymale markører (dvs. N-cadherin, Snail, Slug og Zeb2). Vi har også udført indirekte immunfluorescens farvning af E-cadherin og direkte fluorescens farvning af F-actin. Disse assays yderligere valideret mesenchymal fænotype af celler efter TGF-β behandling. Begrænsningen af immunfluorescensfarvning er, at celler skal rettes før inkubation med antistoffer og billeddannelse, og det er vanskeligt at undersøge ændringer i EMT-markørudtryk i levende celler. For nylig har udformningen af EMT reporter cellelinjer, såsom A549 lunge adenocarcinoma-vimentin-RFP, gjort det muligt at overvåge omdannelsen af epitelceller til mesenchymale celler i realtid via udtryk for rødt fluorescerende protein (RFP)-mærket vimentin. Denne platform kunne bruges til narkotikascreening og ny lægemiddeludvikling46. LifeAct farvestof, en 17-amino-syre peptid, der kan plette F-actin strukturer i levende celler, er ved at blive et værdifuldt redskab til at visualisere actin cytoskeleton i realtid uden at forstyrre cellulære processer47. I denne undersøgelse brugte vi to småmolekylehæmmere, SB431542 og GW788388, til at validere deres hæmmende virkning på TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT. Især GW788388 hæmmer kraftigt TβRI- og TβRII-aktiviteten, mens SB431542 kun har en hæmmende virkning på TβRI (og ALK4 og ALK7). Tidligere undersøgelser viste, at GW788388 er mere potent in vivo end SB43154240. Ud over hæmning af EMT reducerede GW788388 udtrykket af fibrosemarkører i nyrerne, og oral administration af GW788388 i diabetiske mus faldt markant glomerulopati25,48.
EMT spiller en væsentlig rolle i at fremme kræft celle plasticitet og resulterer i resistens over for lægemidler og metastaser 49. Derfor er det blevet foreslået at målrette EMT-afledte celler med specifikke cytotoksiske lægemidler50 eller fremkalde redifferentiering via mesenchymal-til-epitelovergang (MET)51 som en tilgang til at overvinde kræftcellemetastase og terapiresistens. Met bidrager imidlertid til spredning af udbredte kræftceller i fjerne organer52, som kan virke mod hensigten, når der anvendes terapeutisk reversion af EMT. For nylig rapporterede en ny undersøgelse en terapeutisk transdifferentiation tilgang ved direkte at målrette EMT-afledte brystkræftceller til differentiering i adipocytter30. Undersøgelsen af Ishay-Ronen et. al.30 brugte Py2T murine epitelkræftceller, der havde gennemgået en overgang til mesenchymale celler som reaktion på langvarig behandling med TGF-β. De viste, at rosiglitazone i kombination med MEK-hæmmere forbedrede epiteldifferentiering og adipogenesis. Men vi fandt, at rosiglitazone alene var tilstrækkelig til at fremkalde transdifferentiation af mesenchymale Py2T murinceller i adipocytter.
Sammenfattende gav de metoder, der blev anvendt i denne undersøgelse, en logisk arbejdsgang til at undersøge TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT. De to hæmmere, SB431542 og GW788388, kan blokere TGF-β-inducerede reaktioner og EMT. Derudover har vi også vist rosiglitazone alene inducerer adipogenesis i visse TGF-β-induceret mesenchymale brystkræftceller. Selv om vi brugte kun flere brystkræft cellelinjer til at undersøge TGF-β svar, de metoder, der er beskrevet her kunne ekstrapoleres til andre (kræft) celler. Her brugte vi forskellige TGF-β koncentrationer til at fremkalde cellulære reaktioner. I de fleste celletyper udøver TGF-β sin biologiske aktivitet i koncentrationsområdet 0,01-10 ng/mL53 og fremkalder signalering i et dosisresponsmønster. I primære endotelceller, herunder kvægaortatelceller, nåede TGF-β det betydelige udtryk for fosforineret SMAD2 ved 0,025 ng/mL, et maksimum på 0,25 mL og forblev på dette niveau som reaktion på højerekoncentrationer 53. I vores undersøgelse, brugte vi en høj koncentration af TGF-β (5 ng / mL) i MCF10A-Ras celler for transskriptionelle reporter analyse for at opnå stærke reaktioner. SMAD2 fosforylering og målgenkspression kan induceres af TGF-β ved en lav dosis; således brugte vi 2,5 ng / mL TGF-β til behandling af celler. Den mest egnede arbejdskoncentration afhænger imidlertid af celletypen og de anslåede virkninger. For at bestemme den bedste koncentration af TGF-β anbefales det at behandle cellerne med forskellige doser (fra lav til høj).
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtten fra det kinesiske stipendieråd (CSC) til J.Z. og Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) til P.t.D.
Reagent | |||
18 mm-side square glass coverslips | Menzel Gläser | 631-1331 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Alexa Fluor 555 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21422 | |
Anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | |
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody | Merck Millipore | MAB374 | |
Anti-N-cadherin antibody | BD Biosciences | 610920 | |
Anti-Slug antibody | Cell Signaling Technology | 9585 | |
anti-SMAD2/3 antibody | Becton Dickinson | 610842 | |
Anti-Snail antibody | Cell Signaling Technology | 3879 | |
Anti-Tubulin antibody | Cell Signaling Technology | 2148 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Cholera enterotoxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705060 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
DMEM-high glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
DMEM-high glucose medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11039047 | |
epidermal growth factor (EGF) | Merck Millipore | 01-107 | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWest | S1860-500 | |
GoTaq qPCR Master Mix | PROMEGA | A600X | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 26050088 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
NucleoSpin RNA II kit | BIOKE´ | 740955 | |
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Skimmed milk | Campina: Elk | ||
Equipment | |||
ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001402 | |
CFX Connect Detection System | Bio-Rad | 1855201 | |
Luminometer | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 |