Målet med denne protokollen er å levere dyreavledede og kunstige blodmåltider til Aedes aegypti mygg gjennom en kunstig membranmater og nøyaktig kvantifisere volumet av måltid innta.
Kvinner av visse myggarter kan spre sykdommer mens biting virveldyr verter for å få proteinrike blodmåltider som kreves for eggutvikling. I laboratoriet kan forskere levere dyreavledede og kunstige blodmåltider til mygg via membranmatere, noe som tillater manipulering av måltidssammensetning. Her presenterer vi metoder for å mate blod og kunstige blodmåltider til Aedes aegypti mygg og kvantifisere volumet som forbrukes av individuelle kvinner.
Målrettet fôring og kvantifisering av kunstige/ blodmåltider har bred bruk, inkludert testing av effekten av måltidskomponenter på myggatferd og fysiologi, levering av farmakologiske forbindelser uten injeksjon, og infisere mygg med spesifikke patogener. Legge fluorescein fargestoff til måltidet før fôring gir etterfølgende måltid størrelse kvantifisering. Måltidsvolumet som forbrukes av mygg kan måles enten etter vekt, hvis hunnene skal brukes senere til atferdseksperimenter, eller ved å homogenisere individuelle kvinner i 96-brønnplater og måle fluorescensnivåer ved hjelp av en plateleser som en endepunktanalyse. Kvantifisering av måltidsstørrelse kan brukes til å avgjøre om endring av måltidskomponentene endrer måltidsvolumet, eller om måltidsforbruket varierer mellom myggstammer. Nøyaktig kvantifisering av måltidsstørrelse er også avgjørende for nedstrøms analyser, for eksempel de som måler effekter på vertattraksjon eller fecundity. Metodene som presenteres her kan tilpasses ytterligere for å spore måltidsfordøyelsen i løpet av dager eller for å inkludere flere skilleverdige markører lagt til forskjellige måltider (som nektar og blod) for å kvantifisere forbruket av hvert måltid med en enkelt mygg.
Disse metodene gjør det mulig for forskere å utføre målinger med høy gjennomstrømning for å sammenligne måltidsvolumet som forbrukes av hundrevis av individuelle mygg. Disse verktøyene vil derfor være bredt nyttige for myggforskere for å svare på ulike biologiske spørsmål.
Vi presenterer en protokoll for fôring av modifiserte blodmåltider til Aedes aegypti mygg ved hjelp av en kunstig membranmater og nøyaktig måling av måltidsvolumet som forbrukes av hver enkelt mygg. Denne protokollen kan fleksibelt tilpasses for å endre innholdet i måltidet eller for å sammenligne måltidsvolumet som forbrukes av forskjellige eksperimentelle grupper av mygg.
Ae. aegypti mygg truer global helse ved å spre patogener som forårsaker sykdommer, inkludert gul feber, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti kvinner er obligatoriske blodmatere; de må konsumere virveldyrblod for å oppnå det nødvendige proteinet for eggutvikling, og hver clutch av egg krever et fullt blodmåltid fra minst en vert6,7,8. Den kvinnelige myggen biter først verten ved å piercing huden med sin stylet og injisere spytt, som inneholder forbindelser som utløser vertens immunrespons9. Hun mater deretter ved å pumpe blod gjennom sin stylet inn i sin midgut. Mens hun bruker et blodmåltid fra en smittet vert, kan hun innta blodbårne patogener6,8, som deretter migrerer fra myggens midgut til spyttkjertlene10. Kvinnelige mygg smittet på denne måten kan spre sykdom ved å injisere patogener sammen med spytt når du biter etterfølgende verter11,12. Å forstå og kvantifisere mekanismene for blodfôringsatferd er avgjørende skritt for å kontrollere overføringen av myggbårne sykdommer.
Mange laboratorieprotokoller for myggoppdragelse og eksperimentering bruker levende dyr, inkludert mus, marsvin eller mennesker som en blodkilde13,14,15,16. Bruk av levende dyr stiller etiske bekymringer samt komplekse krav til personellopplæring, dyreboliger og omsorg, og overholdelse av IACUC-retningslinjene (Institutional Animal Care and Use Committee). Det begrenser også hvilke typer forbindelser som kan leveres til mygg, noe som begrenser studiene som kan utføres17.
Kunstige blodfôringsapparater, som vanligvis bruker et membransystem for å simulere vertshud, er nyttige verktøy for å studere blodfôringsatferd som omgår behovet for vedlikehold av levende verter. Fullblod kan kjøpes fra en rekke leverandører og mates til mygg ved hjelp av oppvarmede, vannjakkede kunstige membranmatere eller lignendeenheter 18,19. I denne protokollen demonstrerer vi bruken av små, engangsmembranmatere kalt “Glytubes”. Denne membranmateren, tidligere utgitt av Costa-da-Silva et al. (2013)20,kan enkelt monteres fra standard laboratorieutstyr, noe som gjør den ideell for å levere blodmåltider til moderate antall mygg og grei å skalere opp for testing av større grupper eller flere måltidsformuleringer. Glytube er et billig og effektivt alternativ til andre kommersielle kunstige matere, noe som kan kreve større måltidsvolumer og er mer egnet for batchfôring av store grupper mygg på en enkelt måltidsformulering21.
Denne protokollen inneholder to seksjoner: tilberedning/levering av kunstige måltider og kvantifisering av forbruk. I den første delen brukes Glytubes som et effektivt middel for å levere manipulerte dietter. Fullblod kan erstattes med et helt kunstig måltid for å sammenligne effekten av bloderstatninger i stedet for et blodmåltid. En oppskrift tilpasset fra Kogan (1990)22 presenteres her, selv om flere kunstige måltidsformuleringer erutviklet 23,24. Videre er fôring en mindre invasiv og mindre arbeidskrevende metode for å introdusere farmakologiske forbindelser enn injeksjon. På grunn av det lave totale volumet som kreves for hvert måltid (1–2 ml), gir denne protokollen en attraktiv leveringsmetode for å redusere mengden dyre reagenser. Aegypti kvinner lett konsumere proteinfrie måltider av saltløsning med adenosin 5′-trifosfat (ATP)25,26, som gir en grunnlinje for måling av effekten av enkelt måltid komponenter. For eksempel er Neuropeptide Y-lignende reseptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti kjent for å megle vertssøkende undertrykkelse etter et proteinrikt blodmåltid, og når NPYLR7-agonister legges til et proteinfritt saltvannsmåltid, viser kvinnelige mygg vertssøkende undertrykkelse som ligner på de som har konsumert fullblod7.
I den andre delen presenteres trinn for å kvantifisere volumet av hvert måltid som forbrukes av en individuell kvinnelig mygg. Denne analysen er fluorescensbasert og fanger fôringsstatus i høyere oppløsning enn metoder der kvinner klassifiseres som “matet” eller “ufed” basert på visuell vurdering av abdominal distensjon alene. Ved å legge fluorescein til måltidet før fôring, kan måltidsvolumer innta av individer kvantifiseres ved å homogenisere hver mygg i en 96-brønns plate og måle fluorescensintensitet som en avlesning. Denne analysen kan måle forskjeller i fôringskraft som svar på variabler som måltidssammensetning eller myggenes genetiske bakgrunn. Presis kvantifisering er avgjørende for mellomliggende måltidsstørrelser, for eksempel når kvinner tilbys suboptimale måltider som inneholder fôring avskrekkende eller når de bruker sukrose måltider av varierende størrelser27. Hvis matet mygg er nødvendig for påfølgende atferdsanalyser etter måltidstørrelse kvantifisering, kan måltidsstørrelsen i stedet beregnes ved å veie bedøvede kvinner i grupper og estimere gjennomsnittlig økt masse per person. Selv om det er mindre presist enn fluoresceinmerking, gir veiing fortsatt et aggregert estimat av måltidsvolum og tillater undersøkelse av måltidets effekt på nedstrøms prosesser, for eksempel fecundity eller påfølgende vertattraksjon. Mens blod måltidsstørrelsen er variabel og kan påvirkes av en myriadeav faktorer 11,28,29, innta måltidsstørrelser målt med metodene som er beskrevet her, er i samsvar med tidligere kvantifiseringer7,30,31.
For mange laboratorieapplikasjoner tilbyr kunstige membranmatere forskjellige fordeler sammenlignet med levende verter ved å tillate forskere muligheten til å manipulere innholdet i måltidet direkte. Selv om flere metoder er tilgjengelige for kunstig membranfôring, gir metoden som er beskrevet her fordeler i fleksibilitet, kostnad og gjennomstrømming. Sammenlignet med andre kommersielle membranmatere krever Glytube-analysen et lite måltidsvolum, noe som gjør det til en effektiv leveringsmekanisme for kostbare reagenser, inkludert stoffer eller patogener, ved å minimere det totale volumet som kreves7,35. Som både protein-fri saltvann og kunstige blod måltider fremme engorgement, forbindelser eller patogener kan legges til enten måltid som en høy gjennomstrømning og ikke-invasiv alternativ til injeksjoner. I tillegg kan hver komponent av Glytube enkelt vaskes, erstattes eller skaleres opp for å levere og kvantifisere flere måltidstyper uten krysskontaminering av fôringsapparatet.
For å kvantifisere måltidsvolumer som forbrukes av mygg, muliggjør fluorescensbasert metode mer presis måltidsstørrelse kvantifisering enn å veie myggene før og etter fôring. Det bør bemerkes at denne metoden er en sluttpunktanalyse. I motsetning gjør veiing at myggene kan holdes i live for videre eksperimentering. Ved å bruke en plateleser kan den fluorescensbaserte metoden enkelt skaleres opp for kvantifisering av måltider som forbrukes av hundrevis av individuelle kvinner.
For å oppnå høye fôringshastigheter må en kombinasjon av tilstrekkelige vertssignaler være til stede for å aktivere kvinnelig vertssøkende oppførsel og tiltrekke kvinner til materen. Hvis mygg ikke er overfylt under Glytube, kan måltidet ikke varmes riktig, eller CO2 levering kan ikke være tilstrekkelig. Tilsetning av menneskelig lukt til membranoverflaten øker pålitelig attraktiviteten til den kunstige membranen. Hvis mygg observeres under Glytube, men ikke klarer å mate, kan måltidssammensetningen være feil. Kvinner kan ikke mate hvis måltidet i seg selv ikke er varmt, blodet er for gammelt, eller hvis tilsetningsstoffene til måltidet er iboende aversive eller forårsaker en uønsket kjemisk reaksjon36. Ytterligere ATP øker også fôringshastighetene på en pålitelig måte og kan skaleres opp til en endelig konsentrasjon på 2 mM i hver av oppskriftene som tilbys. Kvinner kan ikke mate hvis parafilmen ikke trekkes stramt over Glytube-hetten; parafilmen skal være jevnt gjennomsiktig og bør ikke spenne, da dette hindrer kvinnen i å effektivt pierce parafilmen med sin stylet. Hvis måltidet lekker gjennom Glytube på nettet, kan parafilmen ha revet under strekkprosessen og bør byttes ut.
Endring av måltidssammensetningen kan også tillate forskere å manipulere hvor lang tid som trengs for å fjerne måltidet fra midtgut, samt den påfølgende vertssøkende oppførselen. Måltidene som presenteres her krever 24-36 timer forfordøyelsen 7 lik animalsk-avledet blod. Etter fôring på noen av disse måltidene, vil kvinner undertrykke vertssøkende under fordøyelsestidsvinduet. Siden saltvannsmåltidet mangler protein, går kvinner tilbake til vertssøkende etter at måltidet er ryddet. Hvis en raskere avkastning er ønskelig, kan forskerne velge alternative “rask rydding” saltvannsmåltider som utskilles i ca. 6 t27. Mens sammensetningen av saltvannsmåltidet som presenteres her, er matchet for å sammenligne resultatene direkte med det kunstige blodmåltidet, matcher det “raske clearing” måltidet nærmere fysiologiske saltnivåer som finnes i virveldyrblod.
Metodene som er beskrevet her har begrensninger som bør vurderes før du velger analysen som passer best til forskerens eksperimentelle mål. Fluoresceinmålingene som er beskrevet, tillater ikke mygg som brukes igjen til ytterligere eksperimentering. Vektmålinger kan imidlertid tas før kvantifisering av måltidsstørrelse ved hjelp av fluoresceinsanalysen. Hvis vekt og måltidsstørrelse er konsistent på tvers av flere forsøk for et gitt måltid, kan vekten brukes som proxy i fremtidige eksperimenter. Videre skiller denne protokollen ikke mellom underskudd i vertssøkende versus blodfôringsatferd; mygg som viser nedsatt funksjonsevne i å finne membranmateren vil ha en reduksjon i fôringshastigheter og / eller måltidsstørrelse. Ved å legge til et kamera for å registrere atferd gjennom hele analysen, kan forskerne avgjøre om hunnene ikke finner Glytube, eller om de finner Glytube, men ikke mater.
Analysen som er beskrevet her, kan tilpasses for å utforske mange fremragende spørsmål knyttet til fôringsatferd hos mygg. For eksempel kan bidraget fra spesifikke blodproteiner utforskes ved å endre forholdet mellom bestanddeler eller total proteinkonsentrasjon i det kunstige blodmåltidet. For å evaluere måltidsstørrelser fra flere fôringshendelser, kan fargestoffer med distinkt fluorescensspektra legges til for å skille måltider fra unikekilder 37. Denne protokollen kan også endres for å stimulere de indre munndelene som oppdager blod og som brukes til inntak (det vil si stylet), og de kjemosensoriske vedleggene som kontakter huden (det vil si labium, ben) som mygglander for å begynne blodfôring36. For eksempel, hvis ligandes legges direkte til måltidet, kontakter de ikke labium og ben, siden membranen bare gjennombores av styleten. Hvis ligandene legges til den ytre overflaten av parafilmen i stedet, forblir de atskilt fra måltidet og kan kontaktes av labium og ben36. Til slutt er de detaljerte kinetikkene til blodfôringsatferd ikke godt forstått, og metoden som presenteres her, kan endres for å kombinere høyoppløselig sporing med maskinlæringsverktøy for å trekke ut atferdsavlesninger av bevegelse, holdning og fôringsdynamikk38.
Denne protokollen er rettet mot å være brukervennlig og kostnadseffektiv, med evnen til å tjene forskere som bruker farmakologiske og genetiske manipulasjoner for å studere myggblodfôring og post-blod-fôringsatferd.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai og Trevor Sorrells for kommentarer til manuskriptene, og Zhongyan Gong og Kyrollos Barsoum for teknisk assistanse. Vi takker Alex Wild for fotografier som brukes i figur 1. K.V. ble støttet av Boehringer Ingelheim Fonds PhD-stipend. V.J. ble delvis støttet av NIH T32-MH095246. Dette arbeidet ble delvis støttet av et stipend til Rockefeller University fra Howard Hughes Medical Institute gjennom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programmet til V.J. Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 til V.J. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatteren(e) og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.
15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
Laboratory wrapping film – parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
Rubber bands | |||
Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
Vortex mixer | |||
Water bath | Alternate heating device may be used | ||
White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |