Målet med denne protokol er at levere animalske og kunstige blod måltider til Aedes aegypti myg gennem en kunstig membran feeder og præcist kvantificere mængden af måltid indtages.
Kvinder af visse mygarter kan sprede sygdomme, mens bidende hvirveldyr værter for at opnå proteinrige blod måltider, der kræves for æg udvikling. I laboratoriet kan forskere levere animalske og kunstige blodmåltider til myg via membranfodere, som giver mulighed for manipulation af måltidssammensætningen. Her præsenterer vi metoder til fodring af blod og kunstige blod måltider til Aedes aegypti myg og kvantificere mængden forbruges af de enkelte kvinder.
Målrettet fodring og kvantificering af kunstige / blod måltider har bred anvendelse, herunder test af virkningerne af måltid komponenter på myg adfærd og fysiologi, levere farmakologiske forbindelser uden injektion, og inficere myg med specifikke patogener. Tilsætning af fluoresceinfarvestof til måltidet inden fodring giver mulighed for efterfølgende kvantificering af måltidsstørrelse. Måltidsvolumen, der forbruges af myg, kan måles enten efter vægt, hvis hunnerne senere skal bruges til adfærdseksperimenter eller ved at homogenisere individuelle kvinder i 96-brøndsplader og måle fluorescensniveauer ved hjælp af en pladelæser som et slutpunktsanalyse. Quantificering af måltidsstørrelse kan bruges til at afgøre, om ændring af måltidskomponenterne ændrer det forbrug af mel, der indtages, eller om måltidsforbruget varierer mellem myggestammer. Præcis måltid størrelse kvantificering er også afgørende for nedstrøms assays, såsom dem, der måler effekter på vært attraktion eller fecundity. De metoder, der præsenteres her, kan tilpasses yderligere til at spore måltidsfordøjelsen i løbet af dage eller til at omfatte flere skelnelige markører, der tilsættes forskellige måltider (som nektar og blod) for at kvantificere forbruget af hvert måltid med en enkelt myg.
Disse metoder giver forskere mulighed for egenhændigt at udføre målinger med høj gennemstrømning for at sammenligne måltidsvolumen, der forbruges af hundreder af individuelle myg. Disse værktøjer vil derfor være bredt nyttige for myggeforskere til at besvare forskellige biologiske spørgsmål.
Vi præsenterer en protokol til fodring af modificerede blodmåltider til Aedes aegypti myg ved hjælp af en kunstig membran feeder og præcist måle måltidet volumen forbruges af hver enkelt myg. Denne protokol kan fleksibelt tilpasses for at ændre måltidets indhold eller for at sammenligne måltidsvolumen, der forbruges af forskellige eksperimentelle grupper af myg.
Ae. aegypti myggen truer den globale sundhed ved at sprede patogener, der forårsager sygdomme, herunder gul feber, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti hunner er obligate blod-feeders; de skal forbruge hvirveldyr blod for at opnå det nødvendige protein til æg udvikling, og hver kobling af æg kræver en fuld blodmel fra mindst én vært6,7,8. Den kvindelige myg bider først sin vært ved at gennembore huden med sin stylet og injicere spyt, som indeholder forbindelser, der udløser værtens immunrespons9. Hun fodrer derefter ved at pumpe blod gennem hendes stylet ind i hendes midgut. Mens hun indtager et blodmåltid fra en inficeret vært, kan hun indtage blodbårne patogener6,8, som derefter migrerer fra myggens midgut til hendes spytkirtler10. Kvindelige myg smittet på denne måde kan sprede sygdom ved at injicere patogener sammen med spyt, når de bider efterfølgende værter11,12. Forståelse og kvantificering af mekanismerne for blodfodringsadfærd er afgørende skridt til at kontrollere overførslen af mygbårne sygdomme.
Mange laboratorieprotokoller til mygopdræt og -forsøg bruger levende dyr, herunder mus, marsvin eller mennesker som blodkilde13,14,15,16. Brugen af levende dyr pålægger etiske bekymringer samt komplekse krav til personaleuddannelse, dyreopstaldning og -pleje og overholdelse af institutionelle politikker for dyrepleje og -anvendelse (IACUC). Det begrænser også de typer forbindelser, der kan leveres til myg, hvilket begrænser de undersøgelser, der kan udføres17.
Kunstige blodfodringsapparater, som typisk bruger et membransystem til at simulere værtshud, er nyttige værktøjer til at studere blodfodringsadfærd, der omgår behovet for vedligeholdelse af levende værter. Fuldblod kan købes fra en række leverandører og fodres til myg ved hjælp af opvarmede, vandjakkede kunstige membranfødere eller lignende enheder18,19. I denne protokol demonstrerer vi brugen af små, engangsmembranfødere navnene “Glytubes”. Denne membran feeder, tidligere udgivet af Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan let samles fra standard laboratorieudstyr, hvilket gør det ideelt til at levere blod måltider til moderate antal myg og ligetil at skalere op til test af større grupper eller flere måltidsformuleringer. Glytube er et billigt og effektivt alternativ til andre kommercielle kunstige fødefodere, som kan kræve større måltidsmængder og er mere egnede til batchfodring af store grupper myg på en enkelt måltidsformulering21.
Denne protokol indeholder to afsnit: tilberedning/levering af kunstige måltider og kvantificering af forbruget. I det første afsnit bruges Glytubes som et effektivt middel til at levere manipulerede kostvaner. Fuldblod kan erstattes med et helt kunstigt måltid for at sammenligne virkningerne af bloderstatninger i stedet for et blodmåltid. En opskrift tilpasset fra Kogan (1990)22 præsenteres her, selv om flere kunstige måltid formuleringer er blevet udviklet23,24. Desuden er fodring en mindre invasiv og mindre besværlig metode til at indføre farmakologiske forbindelser end injektion. På grund af den lave samlede mængde, der kræves til hvert måltid (1-2 mL), giver denne protokol en attraktiv leveringsmetode til at reducere mængden af dyre reagenser. Ae. aegypti hunner let forbruge protein-fri måltider af saltvand løsning med adenosin 5′-triphosphat (ATP)25,26, som giver en baseline for måling af virkningerne af enkelt måltid komponenter. For eksempel er Neuropeptide Y-lignende receptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti kendt for at mægle værtssøgende undertrykkelse efter et proteinrigt blodmåltid, og når NPYLR7-agonister tilsættes til et proteinfrit saltvandsmåltid, udviser kvindelige myg værtssøgende undertrykkelse svarende til dem, der har indtaget hele blod7.
I det andet afsnit præsenteres trin til kvantificering af mængden af hvert måltid, der forbruges af en individuel kvindelig myg. Denne analyse er fluorescens-baseret og fanger fodring status i højere opløsning end metoder, hvor kvinder er klassificeret som “fodret” eller “unfed” baseret på visuel vurdering af abdominal distension alene. Ved at tilsætte fluorescein til måltidet før fodring kan måltidsmængder, der indtages af enkeltpersoner, kvantificeres ved at homogenisere hver myg i en 96-brønds plade og måle fluorescensintensitet som en udlæsning. Denne analyse kan måle forskelle i fodring kraft som reaktion på variabler såsom måltid sammensætning eller myg ‘genetiske baggrund. Præcis kvantificering er afgørende for mellemmåltidsstørrelser, f.eks. Hvis fodret myg er nødvendige for efterfølgende adfærdsmæssige assays efter måltid størrelse kvantificering, måltid størrelse kan i stedet beregnes ved at veje bedøvede hunner i grupper og anslå den gennemsnitlige øgede masse pr person. Selv om vejningen er mindre præcis end fluorescerende mærkning, giver den stadig et samlet skøn over måltidsvolumen og gør det muligt at undersøge måltidets virkning på downstream-processer, såsom fecundity eller efterfølgende værtsattraktion. Mens blodmel størrelse er variabel og kan påvirkes af et utal af faktorer11,28,29, indtages måltid størrelser målt med de metoder, der er beskrevet her , er i overensstemmelse med tidligere kvantificeringer7,30,31.
Til mange laboratorieapplikationer tilbyder kunstige membranfødere forskellige fordele sammenlignet med levende værter ved at give forskere mulighed for direkte at manipulere indholdet af måltidet. Selvom flere metoder er tilgængelige til kunstig membranfodring, giver den metode, der er beskrevet her, fordele i fleksibilitet, omkostninger og gennemløb. Sammenlignet med andre kommercielle membranfødere kræver Glytube-analysen et lille måltidsvolumen, hvilket gør det til en effektiv leveringsmekanisme for dyre reagenser, herunder lægemidler eller patogener, ved at minimere det samlede volumen, der kræves7,35. Da både de proteinfri saltvands- og kunstige blodmåltider fremmer engorgement, kan forbindelser eller patogener tilsættes til enten måltidet som et højoverførselshastigheds- og ikke-invasivt alternativ til injektioner. Derudover kan hver komponent i Glytube nemt vaskes, udskiftes eller skaleres op for at levere og kvantificere flere måltidstyper uden krydskontaminering af fodringsapparatet.
For at kvantificere måltidsmængder, der forbruges af myg, muliggør den fluorescensbaserede metode mere præcis måltidsstørrelse kvantificering end vejning af myg før og efter fodring. Det skal bemærkes, at denne metode er en endepunktsanalyse. I modsætning hertil gør vejningen det muligt at holde myggene i live for yderligere eksperimenter. Ved at bruge en pladelæser kan den fluorescensbaserede metode let skaleres op til høj gennemstrømningsquantificering af måltider, der forbruges af hundreder af individuelle kvinder.
For at opnå høje fodringsrater skal der være en kombination af tilstrækkelige værtssignaler til stede for at aktivere kvindelig værtssøgende adfærd og tiltrække kvinder til føderen. Hvis myggene ikke fortrænger under Glytuben, opvarmes måltidet muligvis ikke korrekt, eller CO2-levering er muligvis ikke tilstrækkelig. Tilsætning af menneskelig lugt til membranoverfladen øger pålideligt tiltrækningskraften af den kunstige membran. Hvis myg observeres under Glytube, men undlader at fodre, kan måltidets sammensætning være skyld. Kvinder må ikke fodre, hvis selve måltidet ikke er varmt, blodet er for gammelt, eller hvis tilsætningsstofferne til måltidet i sig selv er aversive eller forårsager en uønsket kemisk reaktion36. Yderligere ATP øger også fodringshastigheden pålideligt og kan skaleres op til en endelig koncentration på 2 mM i hver af de medfølgende opskrifter. Hunnerne må ikke fodre, hvis parafilmen ikke trækkes stramt hen over Glytube-hætten. parafilmen skal være ensartet gennemsigtig og bør ikke spænde, da dette forhindrer kvinden i effektivt at gennembore parafilmen med sin stylet. Hvis måltidet lækker gennem Glytuben på masken, kan parafilmen være revet i stykker under strækningsprocessen og bør udskiftes.
Ændring af måltidet sammensætning kan også give forskerne mulighed for at manipulere den tid, der er nødvendig for at rydde måltidet fra midgut samt den efterfølgende vært-søger adfærd. De måltider, der præsenteres her, kræver 24-36 timer til fordøjelse7 svarende til animalsk blod. Efter fodring på nogen af disse måltider vil kvinder undertrykke værtssøgende i fordøjelsestidsvinduet. Da saltvand måltid mangler protein, hunner vende tilbage til vært-søger efter måltidet er ryddet. Hvis et hurtigere afkast er ønskeligt, kan forskere vælge alternative “hurtig clearing” saltvand måltider, der udskilles i ca 6 timer27. Mens sammensætningen af saltvandsmelet præsenteret her matches for direkte at sammenligne resultater med det kunstige blodmåltid, matcher det “hurtige clearing” måltid bedre fysiologiske saltniveauer, der findes i hvirveldyrblod.
De metoder, der er beskrevet her, har begrænsninger, der bør overvejes, før du vælger den analyse, der passer bedst til forskerens eksperimentelle mål. De beskrevne fluoresceinmålinger tillader ikke, at myg igen anvendes til yderligere forsøg. Vægtmålinger kan dog foretages inden kvantificering af måltidsstørrelse ved hjælp af fluoresceinanalysen. Hvis vægt og måltid størrelse er konsekvente på tværs af flere forsøg for et givet måltid, vægt kan bruges som en proxy i fremtidige eksperimenter. Desuden skelner denne protokol ikke mellem underskud i værtssøgende versus blodfodringsadfærd; myg, der viser funktionsnedsættelser i at finde membranen feeder vil have en reduktion i fodring satser og / eller måltid størrelse. Ved at tilføje et kamera til at optage adfærd i hele analysen, kan forskerne afgøre, om hunnerne ikke kan finde Glytube, eller om de finder Glytube, men ikke foder.
Analysen, der er beskrevet her, kan tilpasses til at udforske mange udestående spørgsmål relateret til fodringsadfærd hos myg. For eksempel kan bidraget fra specifikke blodproteiner undersøges ved at ændre forholdet mellem bestanddele proteiner eller den samlede proteinkoncentration i det kunstige blodmel. For at evaluere måltidsstørrelser fra flere fodringshændelser kan farvestoffer med forskellige fluorescensspektre tilføjes for at skelne måltider fra unikke kilder37. Denne protokol kan også ændres for separat at stimulere de interne mundstykker, der registrerer blod, og som bruges til indtagelse (dvs. stylet), og de kemosensoriske vedhæng, der kontakter huden (dvs. labium, ben), da myggen lander for at begynde blodfodring36. For eksempel, hvis ligands tilsættes direkte til måltidet, kontakter de ikke labium og ben, da membranen kun gennembores af stylet. Hvis der i stedet tilsættes ligands til parafilmens yderside, forbliver de adskilt fra måltidet og kan kontaktes af labium og ben36. Endelig er de detaljerede kinetik af blodfodringsadfærd ikke godt forstået, og den metode, der præsenteres her, kan ændres for at kombinere sporing i høj opløsning med maskinlæringsværktøjer til at udtrække adfærdsmæssige udlæsninger af bevægelse, kropsholdning og fodringsdynamik38.
Denne protokol er rettet mod at være brugervenlig og omkostningseffektiv, med evnen til at tjene forskere, der beskæftiger farmakologiske og genetiske manipulationer til at studere myg blod-fodring og post-blod-fodring adfærd.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai og Trevor Sorrells for kommentarer til manuskripterne og Zhongyan Gong og Kyrollos Barsoum for teknisk bistand. Vi takker Alex Wild for fotografier, der anvendes i figur 1. K.V. blev støttet af Boehringer Ingelheim Fonds ph.d.-stipendium. V.J. blev delvist støttet af NIH T32-MH095246. Dette arbejde blev delvist støttet af et tilskud til The Rockefeller University fra Howard Hughes Medical Institute gennem James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programmet til V.J. Dette materiale er baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 til V.J. Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der kommer til udtryk i dette materiale, er forfatterens(e) udtalelser, resultater og anbefalinger, der kommer til udtryk i dette materiale, og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.
15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
Laboratory wrapping film – parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
Rubber bands | |||
Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
Vortex mixer | |||
Water bath | Alternate heating device may be used | ||
White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |