De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na een hartoperatie. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt onderkoeling een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging. Het onderzoek naar complexe door onderkoeling veroorzaakte moleculaire veranderingen blijft echter beperkt. Daarom is het essentieel om een kweektoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden en die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen in de klinische toestand op een reproduceerbare manier. Om ischemie-achtige aandoeningen in vitro na te bootsen, werden de cellen in deze modellen behandeld met zuurstof/glucosedeprivatie (OGD). Daarnaast hebben we een standaard tijd-temperatuurprotocol toegepast dat wordt gebruikt tijdens hartchirurgie. Verder stellen wij een aanpak voor om een eenvoudige maar alomvattende methode te gebruiken voor de kwantitatieve analyse van myocardletsel. Apoptose en expressieniveaus van apoptose-geassocieerde eiwitten werden beoordeeld door flowcytometrie en met behulp van een ELISA-kit. In dit model hebben we een hypothese getest met betrekking tot de effecten van verschillende temperatuuromstandigheden op cardiomyocyt apoptose in vitro. De betrouwbaarheid van dit model hangt af van strikte temperatuurregeling, controleerbare experimentele procedures en stabiele experimentele resultaten. Bovendien kan dit model worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van hypothermische cardioprotectie te bestuderen, wat belangrijke implicaties kan hebben voor de ontwikkeling van complementaire therapieën voor gebruik met hypothermie.
Ischemie/reperfusie-afgeleide myocarddisfunctie is een veel voorkomend klinisch scenario bij patiënten na hartchirurgie1,2. Tijdens niet-pulserende lage stroomperfusie en perioden van totale bloedsomloopstilstand treedt nog steeds schade op waarbij alle soorten hartcellen betrokken zijn. Met name de gevoeligheid van cardiomyocyten voor ischemisch letsel is hoger dan die van andere celpopulaties. Op dit moment biedt therapeutische hypothermie (TH) een aanzienlijke bescherming tegen een verwachte ischemische belediging bij patiënten die een hartoperatie ondergaan3,4. TH wordt gedefinieerd als een kernlichaamstemperatuur van 14-34 °C , hoewel er geen consensus bestaat over een definitie van koeling tijdens hartchirurgie5,6,7. In 2013 stelde een internationaal panel van deskundigen een gestandaardiseerd rapportagesysteem voor om verschillende temperatuurbereiken van systemische hypothermische bloedsomloopstilstand te classificeren8. Op basis van elektro-encefalografie en metabolismestudies van de hersenen verdeelden ze hypothermie in vier niveaus: diepe onderkoeling (≤ 14 °C), diepe onderkoeling (14,1-20 °C), matige onderkoeling (20,1-28 °C) en milde hypothermie (28,1-34 °C). De consensus van deskundigen zorgde voor een duidelijke en uniforme classificatie, waardoor studies beter vergelijkbaar konden zijn en meer klinisch relevante resultaten konden opleveren. Deze door TH geboden bescherming is gebaseerd op haar vermogen om de metabolische activiteit van cellen te verminderen, waardoor hun hoge-energetische fosfatenverbruik verder wordt beperkt9,10. De rol van TH in myocardbescherming is echter controversieel en kan meerdere effecten hebben, afhankelijk van de mate van onderkoeling.
Myocard I/R staat erom bekend dat het gepaard gaat met verhoogde cel apoptisis11. Recente rapporten hebben waargenomen dat geprogrammeerde cardiomyocytdood toeneemt tijdens openhartchirurgie en kan samenvallen met necrose, waardoor het aantal dode myocardcellentoeneemt 12. Daarom is het verminderen van cardiomyocyt apoptose een nuttige therapeutische benadering in de klinische praktijk. In het muisatriale HL-1 cardiomyocytmodel werd aangetoond dat therapeutische hypothermie de mitochondriale afgifte van cytochroom c en apoptose-inducerende factor (AIF) tijdens reperfusie13vermindert. Het effect van temperatuur bij het reguleren van apoptose is echter controversieel en lijkt afhankelijk te zijn van de mate van onderkoeling. Cooper en collega’s merkten op dat in vergelijking met een normothermische cardiopulmonale bypass-controlegroep, de apoptosesnelheid van myocardweefsel van varkens met de diepe onderkoelde bloedsomloopstilstand werd verhoogdmet 14. Bovendien hebben de resultaten van sommige studies gesuggereerd dat diepe onderkoeling de apoptoseroute kan activeren, terwijl minder agressieve onderkoeling de route12,15,16lijkt te remmen . De reden voor dit resultaat kan te wijten zijn aan verstorende effecten geassocieerd met ischemisch letsel en een gebrek aan begrip van de mechanismen waarmee temperatuur myocardweefsel beïnvloedt. Daarom moeten de temperatuurgrenzen waarmee apoptose wordt versterkt of verzwakt nauwkeurig worden gedefinieerd.
Om een beter begrip te krijgen van de mechanismen die verband houden met de werkzaamheid van onderkoeling en een rationele basis te bieden voor de implementatie ervan bij de mens, is het essentieel om een cultuurtoestand te identificeren die vergelijkbaar is met in vivo omstandigheden die schade kan veroorzaken die vergelijkbaar is met die waargenomen voor de klinische aandoening op een reproduceerbare manier. Een essentiële stap in de richting van het bereiken van dit doel is het vaststellen van de optimale omstandigheden voor het induceren van cardiomyocyt apoptose. Dienovereenkomstig onderzochten we in deze studie de methodologische details met betrekking tot zuurstof-glucose deprivatie-experimenten met gekweekte cellen, een facile in vitro model van ischemie-reperfusie. Verder evalueerden we het effect van verschillende hypoxisch-ischemische tijden op cardiomyocyt apoptose, en verifieerden we onze hypothese met betrekking tot het effect van verschillende temperatuuromstandigheden op celapoptose in vitro.
De complexiteit van intacte dieren, met inbegrip van de interacties tussen verschillende soorten cellen, verhinderen vaak gedetailleerde studies van specifieke componenten van I/R-letsel. Daarom is het noodzakelijk om een in vitro celmodel vast te stellen dat de moleculaire veranderingen na ischemie in vivo nauwkeurig kan weergeven. Onderzoek naar OGD-modellen is eerder gerapporteerd13,22, en vele geavanceerde methoden zijn vastgesteld23<s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), de China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); en het National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |