Évaluation in vitro de la protection myocardique après hypothermie-préconditionnement dans un modèle de myocytes cardiaques humains

Summary

Les effets distincts des différents degrés d’hypothermie sur la protection myocardique n’ont pas été soigneusement évalués. L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle humain à base de cardiomyocytes, jetant les bases d’une recherche moléculaire approfondie future.

Abstract

Le dysfonctionnement myocardique ischémie/reperfusion-dérivé est un scénario clinique commun dans les patients après chirurgie cardiaque. En particulier, la sensibilité des cardiomyocytes aux lésions ischémiques est plus élevée que celle des autres populations cellulaires. À l’heure actuelle, l’hypothermie offre une protection considérable contre une insulte ischémique attendue. Cependant, les investigations sur les changements moléculaires induits par l’hypothermie complexes restent limitées. Par conséquent, il est essentiel d’identifier une condition de culture semblable aux conditions in vivo qui peuvent induire des dommages semblables à ceux observés dans l’état clinique d’une manière reproductible. Pour imiter les conditions ischémiques in vitro, les cellules de ces modèles ont été traitées par privation d’oxygène/glucose (OGD). En outre, nous avons appliqué un protocole standard de température de temps utilisé pendant la chirurgie cardiaque. En outre, nous proposons une approche pour employer une méthode simple mais complète pour l’analyse quantitative des dommages myocardiaux. Les niveaux d’apoptose et d’expression des protéines associées à l’apoptose ont été évalués par cytométrie du débit et à l’aide d’un kit ELISA. Dans ce modèle, nous avons testé une hypothèse concernant les effets de différentes conditions de température sur l’apoptose cardiomyocyte in vitro. La fiabilité de ce modèle dépend d’un contrôle strict de la température, de procédures expérimentales contrôlables et de résultats expérimentaux stables. En outre, ce modèle peut être utilisé pour étudier le mécanisme moléculaire de la cardioprotection hypothermique, qui peut avoir des implications importantes pour le développement de thérapies complémentaires pour une utilisation avec hypothermie.

Introduction

Le dysfonctionnement myocardique ischémique/reperfusion-dérivé est un scénario clinique commun dans les patients après chirurgie^{cardiaque 1,2.} Pendant la perfusion de faible débit nonpulsatile et les périodes d’arrestation circulatoire totale, des dommages impliquant tous les types de cellules cardiaques se produisent toujours. En particulier, la sensibilité des cardiomyocytes aux lésions ischémiques est plus élevée que celle des autres populations cellulaires. À l’heure actuelle, l’hypothermie thérapeutique (TH) offre une protection substantielle contre une insulte ischémique prévue chez les patients^{subissant une chirurgie cardiaque 3,4}. Th est défini comme une température corporelle centrale de 14-34 °C, bien qu’il n’existe aucun consensus concernant une définition du refroidissement pendant la^{chirurgie cardiaque 5,6,7}. En 2013, un groupe international d’experts a proposé un système de déclaration normalisé pour classer diverses plages de température d’arrestation circulatoire hypothermique systémique⁸. Sur la base d’études d’électroencéphalographie et de métabolisme du cerveau, ils ont divisé l’hypothermie en quatre niveaux : hypothermie profonde (≤ 14 °C), hypothermie profonde (14,1-20 °C), hypothermie modérée (20,1-28 °C) et hypothermie légère (28,1-34 °C). Le consensus des experts a fourni une classification claire et uniforme, permettant aux études d’être plus comparables et d’obtenir des résultats plus pertinents sur le plan clinique. Cette protection offerte par TH est basée sur sa capacité à réduire l’activité métabolique des cellules, limitant encore leur taux de consommation de phosphates à haute énergie^9,10. Cependant, le rôle du TH dans la protection myocardique est controversé et peut avoir des effets multiples selon le degré d’hypothermie.

Myocardial I/ R est bien connu pour être accompagné d’une augmentation de l’apoptisis^{cellulaire 11}. Des rapports récents ont observé que la mort programmée de cardiomyocyte augmente pendant la chirurgie à coeur ouvert, et peut coïncider avec la nécrose, augmentant de ce fait le nombre de cellules myocardiques^{mortes 12.} Par conséquent, la réduction de l’apoptose cardiomyocyte est une approche thérapeutique utile dans la pratique clinique. Dans le modèle atrial de cardiomyocyte de HL-1 de souris, l’hypothermie thérapeutique s’est montrée pour réduire la libération mitochondrique du c cytochrome et du facteur apoptosis-induisant (AIF) pendant la reperfusion^13. Cependant, l’effet de la température dans la régulation de l’apoptose est controversé et semble dépendre du degré d’hypothermie. Cooper et ses collègues ont observé que par rapport à un groupe de contrôle cardiopulmonaire normothermique de déviation, le taux d’apoptose du tissu myocardique des porcs avec l’arrêt circulatoire hypothermique profond a^{été augmenté 14.} En outre, les résultats de certaines études ont suggéré que l’hypothermie profonde peut activer la voie de l’apoptose, tandis que l’hypothermie moins agressive semble inhiber la^{voie 12,15,16}. La raison de ce résultat peut être due à des effets confusionnels associés à des lésions ischémiques et un manque de compréhension des mécanismes par lesquels la température affecte le tissu myocardique. Par conséquent, les limites de température auxquelles l’apoptose est améliorée ou atténuée doivent être définies avec précision.

Pour mieux comprendre les mécanismes associés à l’efficacité de l’hypothermie et fournir une base rationnelle pour sa mise en œuvre chez l’homme, il est essentiel d’identifier une condition de culture similaire aux conditions in vivo qui peuvent produire des dommages similaires à ceux observés pour la condition clinique d’une manière reproductible. Une étape essentielle vers la réalisation de cet objectif est d’établir les conditions optimales pour induire l’apoptose cardiomyocyte. En conséquence, dans la présente étude, nous avons exploré les détails méthodologiques concernant les expériences de privation d’oxygène-glucose avec des cellules de culture, un modèle in vitro facile de l’ischémie-reperfusion. En outre, nous avons évalué l’effet de différents temps hypoxiques-ischémiques sur l’apoptose cardiomyocyte, et vérifié notre hypothèse concernant l’effet des différentes conditions de température sur l’apoptose cellulaire in vitro.

Protocol

Les renseignements concernant les réadageurs commerciaux et les instruments sont énumérés dans le Tableau des matériaux. La lignée cellulaire de cardiomyocyte humain AC16 a été dérivée de la fusion des cellules primaires du tissu cardiaque ventriculaire adulte avec les fibroblastes humains SV40-transformés17,qui ont été achetés de BLUEFBIO (Changhaï, Chine). La lignée cellulaire développe de nombreuses caractéristiques biochimiques et …

Representative Results

L’effet de l’exposition aux DG sur la viabilité des HCM a été déterminé par l’essai CCK-8. Comparativement à celle observée dans le groupe témoin, la viabilité des cellules a été considérablement réduite d’une manière dépendante du temps (figure 2A). Les taux d’apoptose des HHC À différents moments après la reperfusion ont montré une tendance spécifique, où de 0 à 16 h, les taux d’apoptose ont graduellement augmenté et ont atteint le taux maximum au point d…

Discussion

Les complexités des animaux intacts, y compris les interactions entre les différents types de cellules, empêchent souvent des études détaillées de composants spécifiques des lésions I/R. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle cellulaire in vitro qui peut refléter avec précision les changements moléculaires après l’ischémie in vivo. La recherche sur les modèles OGD a déjà été^{rapportée 13,22}, et beaucoup de méthodes sophis…

Materials

Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056