인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가
Summary
심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.
Abstract
허혈/재관류 유래 심근 장애는 심장 수술 후 환자에서 일반적인 임상 시나리오입니다. 특히, 허혈성 상해에 심근세포의 감도는 그밖 세포 집단의 그것 보다는 더 높습니다. 현재 저체온증은 예상되는 허혈성 모욕에 대해 상당한 보호를 받고 있습니다. 그러나, 복잡한 저체온증 유도 분자 변화에 대한 조사는 여전히 제한적입니다. 따라서, 재현 가능한 방식으로 임상 조건에서 관찰되는 것과 유사한 손상을 유도할 수 있는 생체 내 조건과 유사한 배양 상태를 식별하는 것이 필수적이다. 시험관 내의 허혈과 같은 조건을 모방하기 위해, 이 모형에 있는 세포는 산소/포도당 박탈에 의해 취급되었습니다 (OGD). 또한, 심장 수술 중에 사용되는 표준 시간 온도 프로토콜을 적용했습니다. 또한 심근 손상의 정량적 분석을 위해 간단하지만 포괄적인 방법을 사용하는 방법을 제안합니다. 세포세포증 및 세포증 관련 단백질의 발현 수준은 유동 세포측정및 ELISA 키트를 사용하여 평가되었다. 이 모델에서는 체외에서 심근세포 세포에 대한 다른 온도 조건의 영향에 관한 가설을 테스트했습니다. 이 모델의 신뢰성은 엄격한 온도 제어, 제어 가능한 실험 절차 및 안정적인 실험 결과에 따라 달라집니다. 추가적으로, 이 모형은 저체온증과 사용하기 위한 보완적인 치료의 발달을 위한 중요한 연루가 있을 수 있는 저체온심 심장 보호의 분자 기계장치를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
허혈/재관류 유래 심근 기능 장애는 심장 수술 후 환자에서 일반적인 임상시나리오1,2. 비박식 낮은 유류 관류 및 총 순환 체포 기간 동안 모든 유형의 심장 세포와 관련된 손상은 여전히 발생합니다. 특히, 허혈성 상해에 심근세포의 감도는 그밖 세포 집단의 그것 보다는 더 높습니다. 현재, 치료 저체온증 (TH)은 심장 수술을 받은 환자에서 예상되는 허혈성 모욕에 대하여 상당한 보호를 제공합니다3,4. TH는 심장 수술중냉각의 정의에 관하여 아무 합의도 존재하지 않더라도 14-34°C의 코어 체온으로 정의됩니다5,6,7. 2013년, 국제 전문가 패널은 체계적인 저체온 순환 순환 정지8의다양한 온도 범위를 분류하기 위해 표준화된 보고 시스템을 제안했습니다. 뇌의 뇌전도 및 신진 대사 연구에 기초하여 저체온증을 4가지 수준으로 나누었습니다: 심오한 저체온증 (≤ 14°C), 깊은 저체온증 (14.1-20 °C), 중간 저체온증 (20.1-28 °C), 및 온화한 저체온증 (28.1-34 °C). 전문가 합의는 명확하고 균일한 분류를 제공, 연구가 더 비교하고 더 임상적으로 관련 된 결과를 제공 할 수 있도록. TH에 의해 제공되는 이 보호는 세포의 신진 대사 활동을 감소시키는 그것의 능력에 근거를 두고, 고에너지 인산염 소비의 그들의 비율을 더 제한하는9,10. 그러나, 심근 보호에서 TH의 역할은 논란의 여지가 있으며 저체온증의 정도에 따라 여러 가지 효과가있을 수 있습니다.
심근 I/R은 세포아포티코(11)를증가시켜 동반하는 것으로 잘 알려져 있다. 최근 보고는 개시 심장 수술 도중 프로그램된 심근세포 죽음이 증가하고, 괴사와 일치할 수 있다는 것을 관찰하고, 이로 인해 죽은 심근 세포의 수를증가시키는 12. 따라서 심근세포 세포증을 감소시키는 것은 임상 실습에서 유용한 치료 접근법이다. 마우스 심방 HL-1 심근세포 모델에서, 치료 저체온증은재퍼퓨전동안 시토크롬 c 및 세포증 유도 인자(AIF)의 미토콘드리아 방출을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 아포토시스 조절에 있는 온도의 효력은 논쟁의 여지가 있고 저체온증의 정도에 의존하는 것처럼 보입니다. 쿠퍼와 동료들은 규범성 심폐 우회 대조군에 비해 깊은 저체온 순환정지를 가진 돼지로부터 심근조직의 자멸율이14로증가했다고 관찰했다. 또한, 일부 연구의 결과는 깊은 저체온증이 자멸 통로를 활성화할 수 있다는 것을 건의하고, 덜 공격적인 저체온증은 통로를 억제하는 것처럼 보이지만12,15,16. 이 결과에 대 한 이유는 허 혈 성 손상과 관련 된 혼란 효과 및 온도 심근 조직에 영향을 미치는 메커니즘의 이해의 부족 때문일 수 있습니다. 따라서, 자멸이 향상되거나 감쇠되는 온도 한계를 정확하게 정의해야 한다.
저체온증의 효능과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하고 인간에서의 구현을 위한 합리적인 기초를 제공하기 위해서는 재현 가능한 방식으로 임상 상태를 관찰한 것과 유사한 손상을 생성할 수 있는 생체 내 조건과 유사한 배양 상태를 식별하는 것이 필수적입니다. 이 목표를 달성하기 위한 필수적인 단계는 심근세포 세포증을 유도하기위한 최적의 조건을 확립하는 것입니다. 따라서, 본 연구에서는 허혈-재퍼퓨전의 시험관내 모델인 배양된 세포를 이용한 산소-포도당 박탈 실험에 관한 방법론적 세부 사항을 탐구하였다. 더욱이, 우리는 심근 세포사멸에 대한 상이한 저산소 허혈시간의 효과를 평가하고, 체외에서 세포 세포 세포 에 대한 다른 온도 조건의 효과에 관한 우리의 가설을 확인했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포의 다른 모형 사이 상호 작용을 포함하여 온전한 동물의 복잡성은 수시로 I/R 상해의 특정 분대의 상세한 연구 결과를 방지합니다. 따라서 생체 내에서 허혈 후 분자 변화를 정확하게 반영할 수 있는 체외 세포 모델을 확립할 필요가 있다. OGD 모델에 대한 연구는 이전에13,22,많은 정교한 방법이 설립되었습니다23,<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81970265, 81900281,81700288), 중국 박사 후 과학 재단(2019M651904)에 의해 부분적으로 지원되었다. 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Materials
| Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
| Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
| Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
| Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
| DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
| Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
| Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
| Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |
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