In vitro-bedömning av myokardskydd efter hypotermiförkonditionering i en human hjärt myocytmodell

Summary

De distinkta effekterna av olika grader av hypotermi på skador skydd har inte utvärderats grundligt. Målet med den aktuella studien var att kvantifiera nivåerna av celldöd efter olika hypotermibehandlingar i en human kardiomyocytbaserad modell, vilket lade grunden för framtida djupgående molekylär forskning.

Abstract

Ischemi/reperfusion-härledda skador dysfunktion är ett vanligt kliniskt scenario hos patienter efter hjärtkirurgi. I synnerhet är känsligheten hos kardiomyocyter för ischemisk skada högre än för andra cellpopulationer. För närvarande ger hypotermi ett betydande skydd mot en förväntad ischemisk förolämpning. Undersökningar av komplexa hypotermi-inducerad molekylära förändringar är dock fortfarande begränsade. Det är därför viktigt att identifiera ett odlingstillstånd som liknar in vivo-tillstånd som kan inducera skador som liknar dem som observerats i det kliniska tillståndet på ett reproducerbart sätt. För att efterlikna ischemiliknande tillstånd in vitro behandlades cellerna i dessa modeller av syre/ glukosbrist (OGD). Dessutom tillämpade vi ett standard tidstemperatur protokoll som används under hjärtkirurgi. Dessutom föreslår vi en metod för att använda en enkel men omfattande metod för kvantitativ analys av skador på skador. Apoptos och uttryck nivåer av apoptos-associerade proteiner bedömdes av flöde cytometri och med hjälp av en ELISA kit. I denna modell testade vi en hypotes om effekterna av olika temperaturförhållanden på kardiomyocyt apoptos in vitro. Tillförlitligheten hos denna modell beror på strikt temperaturkontroll, kontrollerbara experimentella procedurer och stabila experimentella resultat. Dessutom kan denna modell användas för att studera den molekylära mekanismen för hypotermisk kardioprotection, vilket kan ha viktiga konsekvenser för utvecklingen av kompletterande terapier för användning med hypotermi.

Introduction

Ischemi/reperfusion-härledd hjärtmuskeldysfunktion är ett vanligt kliniskt scenario hos patienter efter hjärtkirurgi^1,2. Under nonpulsatile låg flöde perfusion och perioder av totala cirkulations gripande, skador som omfattar alla typer av hjärtceller fortfarande uppstår. I synnerhet är känsligheten hos kardiomyocyter för ischemisk skada högre än för andra cellpopulationer. För närvarande ger terapeutisk hypotermi (TH) betydande skydd mot en förväntad ischemisk förolämpning hos patienter som genomgår hjärtkirurgi^3,4. TH definieras som en kärnkroppstemperatur på 14-34 °C, även om det inte finns någon konsensus om en definition av kylning under hjärtkirurgi^5,6,7. År 2013 föreslog en internationell expertpanel ett standardiserat rapporteringssystem för att klassificera olika temperaturintervall för systemiskt hypotermiskt cirkulationsstopp⁸. Baserat på elektroencefalografi och metabolism studier av hjärnan delade de hypotermi i fyra nivåer: djupgående hypotermi (≤ 14 °C), djup hypotermi (14,1-20 °C), måttlig hypotermi (20,1-28 °C) och mild hypotermi (28,1-34 °C). Expertkonsensus gav en tydlig och enhetlig klassificering, vilket gjorde det möjligt för studier att vara mer jämförbara och ge mer kliniskt relevanta resultat. Detta skydd som TH ger bygger på dess förmåga att minska cellernas metaboliska aktivitet, vilket ytterligare begränsar deras frekvens av högenergifosfatförbrukning^9,10. TH: s roll i skador skydd är dock kontroversiell och kan ha flera effekter beroende på graden av hypotermi.

Hjärtinfarkt I/R är välkänt för att åtföljas av ökad cellapoptis¹¹. Nya rapporter har observerat att programmerad kardiomyocyt död ökar under öppen hjärtkirurgi, och kan sammanfalla med nekros, vilket ökar antalet döda hjärtmuskelceller¹². Därför, minska kardiomyocyt apoptos är ett användbart terapeutiskt tillvägagångssätt i klinisk praxis. I musen förmaksflimmer HL-1 kardiomyocyt modell, terapeutisk hypotermi visade sig minska mitokondriell frisättning av cytokrom c och apoptos-inducerande faktor (AIF) under reperfusion¹³. Effekten av temperaturen vid reglering av apoptos är dock kontroversiell och verkar bero på graden av hypotermi. Cooper och kollegor observerade att jämfört med en normoterm cardiopulmonary bypass kontrollgrupp, apoptos frekvensen av skador vävnad från grisar med djupa hypotermiska cirkulations gripande^{ökades 14}. Dessutom har resultaten från vissa studier föreslagit att djup hypotermi kan aktivera apoptosvägen, medan mindre aggressiv hypotermi verkar hämma vägen^12,15,16. Anledningen till detta resultat kan bero på förvirrande effekter i samband med skandinaviska skada och brist på förståelse för mekanismerna genom vilka temperaturen påverkar hjärtinfarktvävnad. Därför bör de temperaturgränser vid vilka apoptos förstärks eller dämpas definieras noggrant.

För att få en bättre förståelse för mekanismerna i samband med effekten av hypotermi och ge en rationell grund för dess genomförande hos människor, är det viktigt att identifiera ett odlingstillstånd som liknar in vivo-tillstånd som kan producera skador som liknar de som observerats för det kliniska tillståndet på ett reproducerbart sätt. Ett viktigt steg mot att uppnå detta mål är att fastställa de optimala förutsättningarna för att inducera kardiomyocytapoptos. Följaktligen undersökte vi i den aktuella studien metodologiska detaljer om syre-glukos deprivation experiment med odlade celler, en lätt in vitro-modell av ischemi-reperfusion. Dessutom utvärderade vi effekten av olika hypoxic-skandinaviska tider på kardiomyocyt apoptos och verifierade vår hypotes om effekten av olika temperaturförhållanden på cell apoptos in vitro.

Protocol

Information om kommersiella reagenser och instrument finns i materialförteckningen. AC16 mänskliga kardiomyocyt cellinje härleddes från fusion av primära celler från vuxna Ventrikulärt hjärtat vävnad med SV40-omvandlade mänskliga fibroblaster17, som köptes från BLUEFBIO (Shanghai, Kina). Cellinjen utvecklar många biokemiska och morfologiska egenskaper som är karakteristiska för kardiomyocyter. Dessutom används cellinjen ofta för att utv…

Representative Results

Effekten av OGD-exponering på hcms livskraft fastställdes genom CCK-8-analys. Jämfört med den som observerades i kontrollgruppen minskade cellens livskraft avsevärt på ett tidsberoende sätt (figur 2A). Apoptosfrekvensen hos HCMs vid olika tidpunkter efter reperfusion visade en specifik trend, där apoptosfrekvensen gradvis ökade från 0 till 16 timmar och nådde den maximala hastigheten vid 16 h-tidpunkten (figur 2B). Som OGD för 12 h minskad cellaktivi…

Discussion

Komplexiteten hos intakta djur, inklusive interaktioner mellan olika typer av celler, förhindrar ofta detaljerade studier av specifika komponenter i I/R-skada. Därför är det nödvändigt att upprätta en in vitro-cellmodell som exakt kan återspegla de molekylära förändringarna efter ischemi in vivo. Forskning om OGD-modeller har tidigare^{rapporterats 13,22}, och många sofistikerade metoder har^{etablerats 23,}<sup class="xre…

Materials

Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit	Bio-Technology,China	C1062M
Cardiac myocyte growth supplement	Sciencell,USA	6252
Caspase 3 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1115
Caspase 8 activity assay kit	Bio-Technology,China	C1151
DMEM, no glucose	Gibco,USA	11966025
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco,USA	11960044
Fetal bovine serum	Gibco,USA	16140071
Flow cytometry	CytoFLEX,USA	B49007AF
Human myocardial cells	BLUEFBIO,China	BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Bio-Technology,China	C2006
Penicillin/Streptomycin solution	Gibco,USA	10378016
Reactive oxygen species assay kit	Bio-Technology,China	S0033S
Three-gas incubator	Memmert,Germany	ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco,USA	25200056