Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.
İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda hipotermi, beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar. Bununla birlikte, karmaşık hipotermi kaynaklı moleküler değişikliklerle ilgili araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, klinik durumda gözlemlenene benzer hasarlara neden olabilecek in vivo durumlara benzer bir kültür durumunun tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanması esastır. İn vitro iskemi benzeri durumları taklit etmek için, bu modellerdeki hücreler oksijen /glikoz yoksunluğu (OGD) ile tedavi edildi. Ayrıca kalp cerrahisi sırasında kullanılan standart bir zaman-sıcaklık protokolü uyguladık. Ayrıca, miyokard hasarının nicel analizi için basit ama kapsamlı bir yöntem kullanmak için bir yaklaşım öneriyoruz. Apoptoz ilişkili proteinlerin apoptoz ve ekspresyon düzeyleri akış sitometrisi ve ELISA kiti kullanılarak değerlendirildi. Bu modelde, farklı sıcaklık koşullarının kardiyomiyosit apoptoz in vitro üzerindeki etkileri ile ilgili bir hipotezi test ettik. Bu modelin güvenilirliği sıkı sıcaklık kontrolüne, kontrol edilebilir deneysel prosedürlere ve istikrarlı deneysel sonuçlara bağlıdır. Ek olarak, bu model hipotermik kardiyoproteksiyonun moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılabilir, bu da hipotermi ile kullanılmak üzere tamamlayıcı tedavilerin geliştirilmesi için önemli etkileri olabilir.
İskemi/reperfüzyondan türetilmiş miyokard disfonksiyonu kalp cerrahisi sonrası hastalarda sık görülen bir klinik senaryodur1,2. Zengin olmayan düşük akış perfüzyonu ve toplam dolaşım durması dönemlerinde, her türlü kalp hücresini içeren hasarlar oluşmaya devam eder. Özellikle, kardiyomiyositlerin iskemik yaralanmaya duyarlılığı diğer hücre popülasyonlarından daha yüksektir. Şu anda, terapötik hipotermi (TH), kalp cerrahisi uygulanan hastalarda beklenen iskemik hakarete karşı önemli bir koruma sağlar3,4. TH, 14-34 ° C çekirdek vücut sıcaklığı olarak tanımlanır, ancak kalp cerrahisi sırasında soğutma tanımı ile ilgili bir fikir birliği yoktur5,6,7. 2013 yılında, uluslararası bir uzman paneli, sistemik hipotermik dolaşım tutuklamasının çeşitli sıcaklık aralıklarını sınıflandırmak için standartlaştırılmış bir raporlama sistemi önerdi8. Beynin elektroensefalografisi ve metabolizma çalışmalarına dayanarak hipotermiyi dört düzeye ayırdılar: derin hipotermi (≤ 14 °C), derin hipotermi (14.1-20 °C), orta hipotermi (20.1-28 °C) ve hafif hipotermi (28.1-34 °C). Uzman konsensüsü, açık ve düzgün bir sınıflandırma sağlayarak çalışmaların daha karşılaştırılabilir olmasını ve klinik olarak daha alakalı sonuçlar vermesini sağladı. TH tarafından sağlanan bu koruma, hücrelerin metabolik aktivitesini azaltma kapasitesine dayanır ve yüksek enerjili fosfat tüketim hızlarını daha da sınırlar9,10. Bununla birlikte, miyokard korumasında TH’nin rolü tartışmalıdır ve hipotermi dereceine bağlı olarak birden fazla etkiye sahip olabilir.
Miyokard I/R’ye artmış hücre apoptizisi11eşlik ettiği bilinmektedir. Son raporlar, programlanmış kardiyomiyosit ölümünün açık kalp ameliyatı sırasında arttığını ve nekrozla çakışabileceğini ve böylece ölü miyokard hücrelerinin sayısını artırdığını gözlemlemıştır12. Bu nedenle kardiyomiyosit apoptozun azaltılması klinik pratikte yararlı bir terapötik yaklaşımdır. Fare atriyal HL-1 kardiyomiyosit modelinde, terapötik hipotermi, reperfüzyon sırasında sitokrom c ve apoptoz indükleyici faktörün (AIF) mitokondriyal salınımını azalttığı gösterilmiştir13. Bununla birlikte, sıcaklığın apoptozu düzenlemedeki etkisi tartışmalıdır ve hipotermi derecesine bağlı olduğu görülmektedir. Cooper ve meslektaşları, normotermik kardiyopulmoner bypass kontrol grubuna kıyasla, derin hipotermik dolaşım durması olan domuzlardan gelen miyokard dokusunun apoptoz oranının14arttığını gözlemlediler. Ek olarak, bazı çalışmaların sonuçları derin hipotermi apoptoz yolunu aktive edebilirken, daha az agresif hipotermi12 , 15,16yolunu inhibe ediyor gibi görünmektedir. Bu sonucun nedeni, iskemik yaralanma ile ilişkili kafa karıştırıcı etkilerden ve sıcaklığın miyokard dokusunu etkilediği mekanizmaların anlaşılmamasından kaynaklanabilir. Bu nedenle, apoptozun artırıldığı veya zayıfladığı sıcaklık sınırları doğru bir şekilde tanımlanmalıdır.
Hipotermi etkinliği ile ilişkili mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve insanlarda uygulanması için rasyonel bir temel sağlamak için, klinik durum için tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenene benzer hasar üretebilecek in vivo koşullara benzer bir kültür durumunun tanımlanması esastır. Bu hedefe ulaşmak için önemli bir adım, kardiyomiyosit apoptozun indüklene için en uygun koşulları belirlemektir. Bu nedenle, bu çalışmada, iskemi-reperfüzyonun bir facile in vitro modeli olan kültürlü hücrelerle yapılan oksijen-glikoz yoksunluğu deneyleri ile ilgili metodolojik ayrıntıları araştırdık. Ayrıca, farklı hipoksik-iskemik zamanların kardiyomiyosit apoptoz üzerindeki etkisini değerlendirdik ve farklı sıcaklık koşullarının hücreli apoptoz in vitro üzerindeki etkisine ilişkin hipotezimizi doğruladık.
Farklı hücre türleri arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere sağlam hayvanların karmaşıklıkları, genellikle I /R yaralanmasının belirli bileşenlerinin ayrıntılı çalışmalarını önler. Bu nedenle, in vivo iskemi sonrası moleküler değişiklikleri doğru bir şekilde yansıtabilecek bir in vitro hücre modeli oluşturmak gerekir. OGD modelleri üzerinde yapılan araştırmalar daha önce13,22ve birçok sofistike yöntem oluşturulmuştu…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970265, 81900281,81700288), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M651904) tarafından finanse edildi; ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |