Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Summary

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Abstract

Die Erfassung der dynamischen Replikations- und Assemblierungsprozesse von Viren wurde durch den Mangel an robusten In-situ-Hybridisierungstechnologien (ISH) behindert, die eine empfindliche und gleichzeitige Markierung von viraler Nukleinsäure und -protein ermöglichen. Herkömmliche Methoden der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sind oft nicht mit der Immunfärbung kompatibel. Wir haben daher einen bildgebenden Ansatz entwickelt, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of D NA, RNA and protein), der die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von DNA, RNA und Protein ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Fischen verwendet micddrp die verzweigte DNA (bDNA) ISH-Technologie, die die Empfindlichkeit und Detektion von Oligonukleotidsonden drastisch verbessert. Kleine Modifikationen von MICDDRP ermöglichen die Abbildung viraler Proteine gleichzeitig mit Nukleinsäuren (RNA oder DNA) unterschiedlicher Litze. Wir haben diese Protokolle angewendet, um die Lebenszyklen mehrerer viraler Krankheitserreger zu untersuchen, darunter das humane Immundefizienzvirus (HIV)-1, das humane T-lymphotrope Virus (HTLV)-1, das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das Zika-Virus (ZKV) und das Influenza-A-Virus (IAV). Wir haben gezeigt, dass wir virale Nukleinsäuren und Proteine über eine Vielzahl von Viren hinweg effizient markieren können. Diese Studien können uns ein verbessertes mechanistisches Verständnis mehrerer viraler Systeme liefern und dienen darüber hinaus als Vorlage für die Anwendung der Multiplex-Fluoreszenzbildgebung von DNA, RNA und Protein in einem breiten Spektrum zellulärer Systeme.

Introduction

Während Tausende von kommerziellen Antikörpern verfügbar sind, um Proteine über konventionelle Immunfärbungsansätze spezifisch zu markieren, und während Fusionsproteine mit photooptimierten fluoreszierenden Tags zur Verfolgung mehrerer Proteine in einer Probe hergestellt werden können¹, ist die mikroskopische Visualisierung von Proteinen oft nicht kompatibel mit der herkömmlichen DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)² . Technische Einschränkungen bei der gleichzeitigen Visualisierung von DNA, RNA und Protein mit fluoreszenzbasierten Ansätzen haben ein tiefes Verständnis der Virusreplikation behindert. Die Verfolgung von viraler Nukleinsäure und Protein während der Infektion ermöglicht es Virologen, grundlegende Prozesse zu visualisieren, die der Replikation und Assemblierung von Viren zugrunde liegen 3,4,5,6.

Wir haben einen bildgebenden Ansatz entwickelt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)³, der verzweigte DNA (bDNA) in situ Technologie verwendet, um die Empfindlichkeit der Nukleinsäuredetektion zu verbessern 7,8,9 . Darüber hinaus verwendet diese Methode gepaarte Sonden für eine verbesserte Spezifität. bDNA-sequenzspezifische Sonden verwenden verzweigte Vorverstärker- und Verstärker-DNAs, um ein intensives und lokalisiertes Signal zu erzeugen und frühere Hybridisierungsmethoden zu verbessern, die auf wiederholten Regionen in der DNA beruhten⁹. Infizierte Zellen in einem klinischen Kontext enthalten oft kein reichlich vorhandenes virales genetisches Material, was eine Ware für eine empfindliche Methode zum Nachweis fluoreszierender Nukleinsäure in diagnostischen Umgebungen darstellt. Die Kommerzialisierung der bDNA-Technologie durch Ansätze wie RNAscope⁷ und ViewRNA¹⁰ hat diese Nische gefüllt. Die Empfindlichkeit der bDNA-Fluoreszenzbildgebung hat auch einen wichtigen Nutzen in der Zellbiologie, da sie den Nachweis seltener Nukleinsäurespezies in Zellkulturmodellen ermöglicht. Die enorme Verbesserung der Empfindlichkeit macht bDNA-basierte Bildgebungsverfahren für die Untersuchung von Viren geeignet. Ein mögliches Manko ist jedoch, dass sich diese Methoden auf die Visualisierung von RNA oder RNA und Protein konzentrieren. Alle replizierenden Zellen und viele Viren haben DNA-Genome oder bilden während ihres Replikationszyklus DNA, was Methoden, die sowohl RNA und DNA als auch Protein abbilden können, sehr wünschenswert macht.

Im MICDDRP-Protokoll führen wir bDNA-FISH zum Nachweis viraler Nukleinsäure mit der RNAscope-Methode mit Modifikationen⁷ durch. Eine der wichtigsten Änderungen an diesem Protokoll ist die Optimierung der Proteasebehandlung nach chemischer Fixierung. Die Proteasebehandlung erleichtert die Entfernung von Proteinen, die an Nukleinsäure gebunden sind, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern. Auf die Proteasebehandlung folgt die Inkubation mit verzweigten Oligonukleotidsonden. Nach dem Auftragen der bDNA-Sonde(n) werden die Proben gewaschen und anschließend mit Signalvorverstärker- und Verstärker-DNAs inkubiert. Die multiplexierte In-situ-Hybridisierung (ISH), die Markierung mehrerer Gentargets, erfordert Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen für die spektrale Differenzierung⁷. Auf die Inkubation mit DNA-Verstärkern folgt die Immunfluoreszenz (IF).

bDNA ISH bewirkt Verbesserungen des Signal-Rauschens durch Verstärkung zielspezifischer Signale, mit einer Reduktion des Hintergrundrauschens von unspezifischen Hybridisierungsereignissen ^7,11. Zielsonden werden unter Verwendung öffentlich zugänglicher Softwareprogramme entworfen, die die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungsereignisse vorhersagen und die Schmelztemperatur (T_m) des Sonden-Ziel-Hybrids ^7,11 berechnen. Zielsonden enthalten eine 18- bis 25-Basen-Region, die komplementär zur Ziel-DNA/RNA-Sequenz ist, eine Spacer-Sequenz und eine 14-Basen-Schwanzsequenz. Ein Paar Zielsonden, jede mit einer bestimmten Schwanzsequenz, hybridisiert zu einer Zielregion (über ~ 50 Basen). Die beiden Schwanzsequenzen bilden eine Hybridisierungsstelle für die Vorverstärkersonden, die 20 Bindungsstellen für die Verstärkersonden enthalten, die zusätzlich 20 Bindungsstellen für die Markierungssonde enthalten. Zum Beispiel wird eine Region von einer Kilobase (kb) auf dem Nukleinsäuremolekül von 20 Sondenpaaren anvisiert, wodurch ein molekulares Gerüst für die sequentielle Hybridisierung mit dem Vorverstärker, dem Verstärker und der Markierungssonde entsteht. Dies kann somit zu einer theoretischen Ausbeute von 8000 fluoreszierenden Markierungen pro Nukleinsäuremolekül führen, was den Nachweis einzelner Moleküle und enorme Verbesserungen gegenüber herkömmlichen FISH-Ansätzen ermöglicht⁷ (siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung der bDNA-Signalamplifikation). Um Sonden für gemultiplextes ISH einzurichten, muss sich jede Zielsonde in einem anderen Farbkanal befinden (C1, C2 oder C3). Diese Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen besitzen unterschiedliche 14-Basen-Schwanzsequenzen. Diese Schwanzsequenzen binden unterschiedliche Signalverstärker mit verschiedenen Fluoreszenzsonden und ermöglichen so eine einfache spektrale Differenzierung über mehrere Ziele hinweg. Im vorgestellten Protokoll enthält Tabelle 4 de Schritt 9 weitere Informationen zu fluoreszenzmarkierenden Zielsonden. Darüber hinaus zeigen Abbildung 2 und Abbildung 3 Beispiele, wie wir den geeigneten Verstärker 4-FL (A, B oder C) (Fluoreszenzsonde und den letzten Hybridisierungsschritt) ausgewählt haben, um eine spezifische fluoreszierende Markierung mehrerer viraler Nukleinsäureziele nach HIV-1- und HTLV-1-Infektionen zu erreichen.

Wir haben mehrere Anwendungen der simultanen Fluoreszenzvisualisierung von RNA, DNA und Proteinen demonstriert und kritische Stadien der Virusreplikation mit hoher raumzeitlicher Auflösung ^3,4,5 beobachtet. Zum Beispiel hat uns die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von viraler RNA, zytoplasmatischer und nukleärer DNA und Proteinen ermöglicht, Schlüsselereignisse während der HIV-1-Infektion zu visualisieren, einschließlich der Verfolgung von RNA-haltigen Kernen im Zytoplasma vor dem Kerneintritt und der Integration von proviraler DNA³. Darüber hinaus haben wir MICDDRP angewendet, um die Auswirkungen von Wirtsfaktoren und medikamentöser Behandlung auf Virusinfektionen und Replikation zu charakterisieren ^4,5. In Ukah et al. verfolgten wir die Reaktivierung der HIV-1-Transkription in Latenzzellmodellen, die mit verschiedenen Latenzumkehrern behandelt wurden, um die HIV-Transkription und die Latenzumkehrung 4 zu visualisieren^. Darüber hinaus kann MICDDRP es uns ermöglichen, phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit antiviraler Hemmung zu visualisieren, die auf die Behandlung kleiner Moleküle oder die Einschränkung des Wirtsfaktors zurückzuführen sind. Als Proof of Concept für die Robustheit und breite Anwendbarkeit unseres Ansatzes haben wir gezeigt, dass wir Modifikationen unseres Protokolls verwenden können, um virale Nukleinsäure effizient zu markieren, um Infektionen nicht nur im humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1, sondern auch im humanen T-lymphotropen Virus (HTLV)-1, Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Zika-Virus (ZIKV) und Influenza-A-Virus (IAV). Da der HIV-1-Lebenszyklus sowohl aus viraler DNA als auch aus RNA-Spezies besteht, haben wir den Großteil unserer Optimierung von MICDDRP nach HIV-1-Replikationskinetik durchgeführt. Darüber hinaus haben wir jedoch gezeigt, dass wir die Synthese verschiedener viraler RNA-Transkripte von einem oder beiden Sense- (+) und Antisense- (-) Strängen in Viren wie ZIKV, IAV, HBV und HCV verfolgen können, um die virale Transkription und Replikation zu überwachen 3,4,5,6. Die Studien zielen darauf ab, das mechanistische Verständnis mehrerer viraler Prozesse zu verbessern und dienen als Richtlinie für die Implementierung dieser Fluoreszenzbildgebungstechnologie auf ein breites Spektrum von Zellmodellen.

Protocol

1. Samenzellen (Suspension vs. Adhärent Cells) auf Deckgläsern oder Kammerobjektträgern (vorgestelltes Protokoll verwendet Deckgläser). Aussaat von SuspensionszellenBereiten Sie mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtete Deckgläser vor (erleichtert die Anhaftung von Suspensionszellen an Deckglas), indem Sie zuerst Deckgläser in Ethanol (EtOH) für 5 Minuten inkubieren (sterilisiert Deckgläser und entfernt alle Rückstände). Anschließend 2x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen,…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung von MICDDRP. Auf die Markierung von DNA und RNA folgt die Immunfärbung. Die Verwendung von Verzweigungsverstärkern erhöht das Signal und ermöglicht den Nachweis einzelner Nukleinsäuremoleküle. Abbildung 1: Schematische Darstellung von MICDDRP und Schritt-für-Schritt-Workflow….

Discussion

Die gleichzeitige Visualisierung von RNA, DNA und Protein erfordert oft umfangreiche Optimierungen. Zwei häufig verwendete Methoden sind die 5-Ethinyl-2-Desoxyuridin-Markierung (EdU) und die DNA-FISH. Die EdU-Markierung wurde angewendet, um virale DNA und Protein gleichzeitig sichtbar zu machen, da EdU in naszierende DNA eingebaut und anschließend mit azidhaltigen Fluoreszenzfarbstoffen über Klickchemie markiert wird. Die EdU-Markierung kann somit verwendet werden, um die native Virusreplikationskinetik von D…

Materials

4% PFA
50% dextran sulfate	Amreso	198	For DNA hybridization buffer
50X wash buffer	ACD Bio	320058
6-well plates
Amplifier 1-FL	ACD Bio
Amplifier 2-FL	ACD Bio
Amplifier 3-FL	ACD Bio
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody	GeneTex	GTX125923	Antibody against flu protein
Bovine serum albumin			Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements			Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI	ACD Bio		Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	No calcium and magnesium
Ethylene carbonate	Sigma	E26258
Fetal bovine serum (FBS)			Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Nail polish			For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent	ACD Bio	300041	For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride			For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2			For DNA hybridization buffer
Tween-20			For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe	ACD Bio	441361	HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA probe