Inserción co-traduccional de proteínas de membrana en nanodiscos preformados
Summary
La inserción co-traduccional en nanodiscos preformados permite estudiar proteínas de membrana sintetizadas libres de células en ambientes lipídicos definidos sin contacto con detergentes. Este protocolo describe la preparación de los componentes esenciales del sistema y los parámetros críticos para mejorar la eficiencia de la expresión y la calidad de la muestra.
Abstract
Los sistemas de expresión libre de células permiten el diseño personalizado de entornos de reacción para apoyar el plegamiento funcional de proteínas incluso complejas como las proteínas de membrana. Se demuestran los procedimientos experimentales para la inserción co-traslacional y el plegamiento de proteínas de membrana en membranas preformadas y definidas suministradas como nanodiscos. El protocolo es completamente libre de detergente y puede generar miligramos de muestras purificadas en un día. Las muestras resultantes de proteínas de membrana / nanodiscos se pueden usar para una variedad de estudios funcionales y aplicaciones estructurales, como cristalización, resonancia magnética nuclear o microscopía electrónica. Se describe la preparación de componentes clave básicos como lisados libres de células, nanodiscos con membranas diseñadas, soluciones madre críticas, así como el ensamblaje de reacciones de expresión libre de células de dos compartimentos. Dado que los requisitos de plegamiento de las proteínas de membrana pueden ser muy diversos, un enfoque importante de este protocolo es la modulación de los parámetros y los pasos de reacción importantes para la calidad de la muestra, como los compuestos de reacción básicos críticos, la composición de membrana de los nanodiscos, el entorno redox y chaperona, o el diseño de plantillas de ADN. Todo el proceso se demuestra con la síntesis de proteorhodopsina y un receptor acoplado a proteína G.
Introduction
Las proteínas de membrana (MP) son objetivos desafiantes en los estudios de producción de proteínas debido a su insolubilidad en ambientes acuosos. Las plataformas de producción de MP convencionales comprenden sistemas basados en células como E. coli, levadura o células eucariotas. Los MPs recombinantes sintetizados se extraen de las membranas celulares o se vuelven a plegar de los cuerpos de inclusión1. Después de la solubilización del detergente, los MP pueden transferirse a ambientes de membrana adecuados mediante protocolos de reconstitución in vitro establecidos. Además de vesículas y liposomas, la reconstitución de MP en membranas planas en forma de nanodiscos2 o partículas de salipro3 se ha convertido en técnicas de rutina en los últimos tiempos. Sin embargo, todas estas estrategias implican el contacto del detergente con los MP que puede resultar en desestabilización, disociación de oligómeros e incluso pérdida de la estructura y actividad de las proteínas4. Por lo tanto, la detección de condiciones óptimas de solubilización y reconstitución del detergente puede ser tediosa y consumir muchotiempo 5.
La naturaleza abierta de los sistemas libres de células (CF) permite que la reacción de expresión se suministre directamente con membranas preformadas con una composición lipídica definida. En este modo de expresión basado en lípidos (L-CF), los MPs sintetizados tienen la oportunidad de insertarse co-traduccionalmente en las bicapas proporcionadas 6,7 (Figura 1). Los nanodiscos constituidos por una proteína de andamio de membrana (MSP) que rodea un disco de bicapa lipídica plana8 parecen ser particularmente adecuados para esta estrategia 9,10. Los nanodiscos se pueden ensamblar rutinariamente in vitro con una variedad de lípidos diferentes, son muy estables y las existencias se pueden concentrar hasta 1 mM. Sin embargo, la expresión de MSP en E. coli y su purificación es necesaria. Como estrategia alternativa, la MSP puede ser co-expresada junto con el MP objetivo en reacciones de FQ suministradas con liposomas11,12,13. Las plantillas de ADN para MSP y MP se agregan a la reacción y MP / nanodiscos pueden formarse al expresarse. Si bien se evita la producción de MSP, la estrategia de coexpresión requiere un ajuste cuidadoso de las concentraciones finales de la plantilla de ADN y se pueden esperar mayores variaciones en la eficiencia de la producción de muestras.
La inserción co-traduccional de MPs en membranas de nanodiscos preformados es un mecanismo no fisiológico y aún en gran parte desconocido independiente de las maquinarias de translocon y las secuencias de señales13,14,15,16. Los principales determinantes de la eficiencia de inserción son el tipo de proteína de membrana, así como la composición lipídica de la membrana proporcionada, con una preferencia frecuente por lípidos cargados negativamente15,17. Como las membranas de los nanodiscos son relativamente limitadas en tamaño, se libera una cantidad sustancial de lípidos tras la inserción de MP18. La variación del tamaño del nanodisco permite la inserción y puesta a punto de complejos MP oligoméricos superiores15,18. Entre otros, se demostró el correcto ensamblaje de complejos homooligoméricos para el canal iónico KcsA, para la bomba iónica proteorhodopsina (PR) y para el transportador multifármaco EmrE15,18. Es probable que los MP entren en la membrana simétrica del nanodisco desde ambos lados con una frecuencia relativamente igual. Por lo tanto, debe considerarse que diferentes monómeros u oligómeros insertados en un nanodisco pueden tener orientaciones opuestas. Sin embargo, un sesgo en la orientación podría ser causado por mecanismos de inserción cooperativa como se informó para la formación de hexámeros PR y tetrámeros KcsA18. Un sesgo adicional en la orientación de MP podría resultar de interruptores de orientación de MP insertados probablemente en el borde de las membranas de nanodisco.
La producción de lisados de FQ a partir de cepas de E. coli es una técnica de rutina confiable y puede realizarse en casi cualquier laboratorio bioquímico19,20. Debe considerarse que, además de la formación del puente disulfuro, la mayoría de las otras modificaciones postraduccionales están ausentes si se sintetiza un MP utilizando lisados de E. coli. Si bien esto podría generar muestras más homogéneas para estudios estructurales, puede ser necesario excluir los efectos potenciales sobre la función de los objetivos individuales de MP. Sin embargo, la producción eficiente de muestras de alta calidad de receptores acoplados a proteínas G (GPCR)14,21,22, transportadores eucariotas 23 o grandes conjuntos heteroméricos 24 en lisados CF de E. coli indica su idoneidad incluso para objetivos complejos. Se pueden obtener cantidades de escala preparativa (≈ 1 mg/ml) de una muestra con la configuración libre de células de intercambio continuo (CECF) de dos compartimentos, compuesta por una mezcla de reacción (RM) y un compartimento de mezcla de alimentación (FM). El volumen de FM excede el volumen de RM de 15 a 20 veces y proporciona un reservorio de compuestos energéticos de bajo peso molecular y precursores19. La reacción de expresión se extiende así durante varias horas y el rendimiento final del objetivo MP aumenta. Los compartimentos RM y FM están separados por una membrana de diálisis con un corte de 10-14 kDa. Los dos compartimentos requieren un diseño especial del contenedor de reacción CECF (Figura 1). Los casetes de diálisis comerciales como contenedores RM en combinación con contenedores de plexiglás a medida que contienen el FM son ejemplos adecuados. Los rendimientos de MP se pueden manipular modificando las relaciones RM:FM o intercambiando el FM después de un cierto período de incubación.
El rendimiento y la calidad de un MP a menudo requieren una intensa optimización de los parámetros de reacción. Una ventaja importante de la expresión de CF es la posibilidad de modificar y ajustar casi cualquier compuesto de acuerdo con los requisitos individuales de un MP. Una estrategia sencilla es centrarse primero en mejorar el rendimiento de un MP estableciendo un protocolo de producción básico y luego optimizar la calidad del MP ajustando la reacción y las condiciones de plegado. La ausencia de procesos fisiológicos en los lisados de FQ y su reducida complejidad resultan en altas tasas de éxito para la producción eficiente de MPs25. Las consideraciones rutinarias para el diseño de plantillas de ADN y la optimización de la concentración de iones Mg 2+ son en la mayoría de los casos suficientes para obtener rendimientos satisfactorios26. Dependiendo del modo de expresión, la optimización de la calidad de MP puede llevar mucho tiempo, ya que es necesario examinar una mayor variedad de parámetros14,17,22.
Para establecer la plataforma de expresión de FQ descrita, son necesarios protocolos para la producción de lisado de CF de E. coli (i), ARN polimerasa T7 (ii), nanodiscos (iii) y los compuestos básicos de reacción CECF (iv) (Figura 1). Los derivados de E. coli K12 cepa A1927 o BL21 se utilizan con frecuencia para la preparación de lisados eficientes de S30 (centrifugación a 30.000 x g). Además de los lisados S30, se pueden utilizar los lisados correspondientes centrifugados a otras fuerzas g (por ejemplo, S12). Los lisados difieren en la eficiencia de expresión y en la complejidad del proteoma. El proteoma del lisado S30 preparado por el protocolo descrito ha sido estudiado en detalle28. El proteoma S30 todavía contiene algunas proteínas residuales de la membrana externa que podrían dar problemas de fondo sobre la expresión y el análisis de los canales iónicos. Para tales objetivos, se recomienda el uso de lisados S80-S100. Una modificación valiosa durante la preparación del lisado es la inducción de la respuesta SOS por choque térmico combinado y suministro de etanol en la fase de crecimiento logarítmico medio de las células. Los lisados HS30 resultantes están enriquecidos en chaperonas y se pueden utilizar en mezclas con lisados S30 para mejorar el plegado MP22. La expresión de FQ en los lisados de E. coli se opera como un proceso acoplado de transcripción/traducción con plantillas de ADN que contienen promotores controlados por la ARN polimerasa T7 (T7RNAP). La enzima se puede producir eficientemente en células estelares BL21 (DE3) que transportan el plásmido pAR121929.
Dos copias de MSP1E3D1 se ensamblan en un nanodisco con un diámetro de 10-12 nm, pero el protocolo descrito a continuación también puede funcionar para otros derivados de MSP. Sin embargo, los nanodiscos más grandes que los formados con MSP1E3D1 tienden a ser menos estables, mientras que los nanodiscos más pequeños formados con derivados de MSP como MSP1 pueden no acomodar MPs más grandes o complejos MP. Los nanodiscos MSP1E3D1 se pueden ensamblar in vitro con una gran variedad de diferentes lípidos o mezclas de lípidos. Los nanodiscos preformados suelen ser estables durante > 1 año a -80 °C, mientras que la estabilidad puede variar para diferentes componentes lipídicos. Para la detección de los efectos lipídicos sobre el plegamiento y la estabilidad de un MP, es necesario preparar un conjunto completo de nanodiscos ensamblados con una variedad representativa de mezclas de lípidos / lípidos. Los siguientes lípidos pueden dar una buena selección inicial: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) (POPG) y 1-palmitoil-2-oleoil-glycero-3-phosphocholine (POPC).
Se describe un protocolo para la preparación de una reacción CECF de 3 ml. Es posible escalar más arriba o hacia abajo en una proporción de 1: 1. Para la configuración CECF de dos compartimentos, se debe preparar un RM que contenga todos los compuestos y un FM que contenga solo los compuestos de bajo peso molecular. Los dispositivos comerciales de diálisis de 3 ml con MWCO de 10-14 kDa se pueden usar como contenedores RM, que luego se colocan en recipientes de plexiglás hechos a medida que contienen el FM (Figura 1D)30. La relación de RM:FM es de 1:20, por lo que se deben preparar 60 mL de FM para 3 mL RM. La calidad, concentración o tipo de varios componentes pueden ser críticos para el rendimiento final y/o la calidad del MP sintetizado (Tabla 1). Las plantillas de ADN deben prepararse de acuerdo con las directrices publicadas y la optimización del codón del marco de lectura del objetivo puede mejorar significativamente el rendimiento del producto26. Para la reacción CECF a escala preparativa, se describe un protocolo establecido para la producción de PR. Para establecer protocolos de expresión para nuevos MPs, suele ser necesario realizar cribados de optimización de determinados compuestos (Tabla 1) para mejorar el rendimiento y la calidad. Para los iones Mg2+ , existe una concentración óptima bien enfocada que con frecuencia muestra una variación significativa para diferentes plantillas de ADN. Otros compuestos de reacción de CF, como los nuevos lotes de lisados T7RNAP o S30, pueden cambiar aún más la concentración óptima de Mg2+ . Como ejemplo, se describe una pantalla típica de Mg 2+ dentro del rango de concentración de14-24 mM y en pasos de 2 mM. Cada concentración se examina por duplicados y en reacciones CECF a escala analítica. Como contenedor de reacción CECF, los contenedores de plexiglás Mini-CECF30 hechos a medida que contienen el RM se utilizan en combinación con microplacas estándar de 24 pocillos que contienen el FM (Figura 1B). Alternativamente, se pueden usar cartuchos de diálisis comerciales en combinación con microplacas de pocillos de 96 profundidades u otros dispositivos dializadores comerciales en configuraciones apropiadas (Figura 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describen la configuración y las estrategias para optimizar la expresión de CF y la inserción co-traduccional de MP funcionales en nanodiscos. El equipo requerido comprende un biorreactor, un dispositivo de prensa francés o similar, un lector UV / VIS y fluorescencia, recipientes de reacción CF adecuados para una configuración de dos compartimentos y una incubadora de temperatura controlada. Otros equipos estándar son centrífugas para cosechar células de E. coli, así como centrífugas de mesa que al…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la subvención BE1911/8-1 de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), al proyecto GLUE de LOEWE y al centro de investigación colaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) por su apoyo financiero.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
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