Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche
Summary
Questo lavoro delinea un protocollo per ottenere un monitoraggio dinamico e non invasivo del trasferimento di calore dalle nanoparticelle d’oro irradiate al laser ai tBLM. Il sistema combina la spettroscopia di impedenza per la misurazione in tempo reale delle variazioni di conduttanza attraverso i tBBM, con un raggio laser focalizzato orizzontalmente che guida l’illuminazione delle nanoparticelle d’oro, per la produzione di calore.
Abstract
Qui riportiamo un protocollo per studiare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d’oro irradiate (GNP) e membrane lipidiche a doppio strato mediante elettrochimica utilizzando membrane lipidiche a doppio strato (tBLM) assemblate su elettrodi d’oro. I GNP modificati irradiati, come i GNP coniugati con streptaviduina, sono incorporati in tBBM contenenti molecole bersaglio, come la biotina. Utilizzando questo approccio, i processi di trasferimento di calore tra GNP irradiati e membrana lipidica a doppio strato modello con entità di interesse sono mediati da un raggio laser focalizzato orizzontalmente. Il modello computazionale predittivo termico viene utilizzato per confermare i cambiamenti di conduttanza indotti elettrochimicamente nei tBBM. Nelle condizioni specifiche utilizzate, il rilevamento di impulsi di calore richiedeva l’attaccamento specifico delle nanoparticelle d’oro alla superficie della membrana, mentre le nanoparticelle d’oro non legate non riuscivano a suscitare una risposta misurabile. Questa tecnica funge da potente biosensore di rilevamento che può essere utilizzato direttamente per la progettazione e lo sviluppo di strategie per terapie termiche che consentono l’ottimizzazione dei parametri laser, della dimensione delle particelle, dei rivestimenti di particelle e della composizione.
Introduction
Le prestazioni ipertermiche dei nanomateriali d’oro irradiati offrono una nuova classe di trattamento minimamente invasivo, selettivo e mirato per infezioni e tumori1. L’impiego di nanoparticelle che possono essere riscaldate da un laser è stato utilizzato per distruggere selettivamente le cellule malate e fornire un mezzo per la somministrazione selettiva di farmaci2,3. Una conseguenza dei fenomeni di fototermolisi delle nanoparticelle plasmoniche riscaldate è il danno alle membrane cellulari. La membrana a doppio strato lipidico fluido è considerata un sito particolarmente vulnerabile per le cellule sottoposte a tali trattamenti perché la denaturazione delle proteine intrinseche di membrana e il danno alla membrana possono anche portare alla morte cellulare4, poiché molte proteine sono lì per mantenere il gradiente potenziale ionico attraverso le membrane cellulari. Mentre la capacità di determinare e monitorare il trasferimento di calore su scala nanometrica è di fondamentale interesse per lo studio e l’applicazione dei GNP irradiati1,5,6,7, la valutazione e la comprensione delle interazioni molecolari tra GNP e biomemerne, nonché le conseguenze dirette dei fenomeni di riscaldamento indotti dal laser dei GNP incorporati nei tessuti biologici, devono ancora essere pienamente chiariti8. Pertanto, una conoscenza approfondita del processo di ipertermia dei GNP irradiati rimane una sfida. Pertanto, lo sviluppo di un’interfaccia nanomateriale-elettrodo che imita l’ambiente naturale delle cellule potrebbe fornire un mezzo per intraprendere un’indagine approfondita delle caratteristiche di trasferimento di calore delle nanoparticelle d’oro irradiate all’interno dei sistemi biologici.
La complessità delle membrane cellulari native è una delle sfide significative nella comprensione delle interazioni dei GNP irradiati nelle cellule. Sono state sviluppate varie piattaforme di membrana artificiale per fornire versioni bio-mimetiche semplici dell’architettura e della funzionalità della membrana lipidica naturale, tra cui, ma non solo, membrane lipidiche nere9,membrane a doppio strato planare supportate10,membrane ibride a doppio strato11,membrane a doppio strato lipidico ammortizzate con polimeri12 e membrane lipidiche a doppio strato legate13. Ogni modello di membrana lipidica artificiale presenta vantaggi e limitazioni distinti rispetto all’imitazione delle membrane lipidiche naturali14.
Questo studio descrive l’impiego di elettrodi rivestiti di membrana lipidica come sensore per valutare le interazioni tra nanoparticelle d’oro e membrana lipidica, utilizzando il modello tBLM. Lo schema di rilevamento del biosensore basato su tBLM fornisce stabilità e sensibilità intrinseche13 in quanto le membrane legate possono autoriparazione, a differenza di altri sistemi (come le membrane formate da patch-clamp o liposomi) in cui solo una piccola quantità di danni alla membrana provoca il loro collasso15,16,17,18. Inoltre, poiché i tBBM sono di dimensioni mm2, l’impedenza di fondo è di ordini di grandezza inferiore rispetto alle tecniche di registrazione patch-clamp, che consente una registrazione dei cambiamenti nel flusso ionico della membrana basale dovuti alle interazioni delle nanoparticelle. Di conseguenza, il presente protocollo può contrastare i cambiamenti nella conduttanza della membrana da parte di GNP legati che sono eccitati da laser le cui potenze sono basse come 135 nW / μm2.
Il sistema qui presentato fornisce un metodo sensibile e riproducibile per determinare precisi parametri laser, dimensione delle particelle, rivestimenti di particelle e composizione necessari per progettare e sviluppare terapie termiche. Questo è fondamentale per il perfezionamento delle terapie fototermiche emergenti, oltre a offrire preziose informazioni per meccanismi dettagliati di trasferimento di calore all’interno dei sistemi biologici. Il protocollo presentato si basa sul lavoro precedentemente pubblicato19. Uno schema del protocollo è il seguente: la prima sezione definisce la formazione di tBLM; la seconda sezione delinea come costruire il setup e allineare la sorgente laser di eccitazione; la sezione finale illustra come estrarre informazioni dai dati della spettroscopia di impedenza elettrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’uso del modello tBLM con un substrato di elettrodo complanare in combinazione con un allineamento laser orizzontale impostato che consente la registrazione dell’impedenza elettrica in tempo reale in risposta all’irradiazione laser di nanoparticelle d’oro. Il metodo di registrazione EIS qui presentato costruisce un elenco minimo di esperimenti necessari per fornire la registrazione dei cambiamenti di corrente ionica attraverso la membrana, che corrisponde al ca…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) e dall’ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).
Materials
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
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