Geautomatiseerde loopanalyse is een haalbaar hulpmiddel om functioneel herstel te evalueren in knaagdiermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesie. Hoewel het slechts één opstelling vereist om de motorische functie in verschillende experimentele modellen te beoordelen, is nauwgezette hard- en soft-ware aanpassing en training van de dieren zeer belangrijk.
Perifere en centrale zenuwverwondingen worden meestal bestudeerd bij knaagdieren, met name ratten, gezien het feit dat deze diermodellen zowel kosteneffectief zijn als veel vergelijkende gegevens in de literatuur zijn gepubliceerd. Dit omvat een veelheid van beoordelingsmethoden om functioneel herstel te bestuderen na zenuwletsel en reparatie. Naast evaluatie van zenuwregeneratie door middel van histologie, elektrofysiologie en andere in vivo en in vitro beoordelingstechnieken, is functioneel herstel het belangrijkste criterium om de mate van neurale regeneratie te bepalen. Geautomatiseerde ganganalyse maakt het mogelijk om een enorme hoeveelheid ganggerelateerde parameters zoals Paw Print Area en Paw Swing Speed op te nemen, evenals maatregelen voor interlede-ledcoördinatie. Bovendien biedt de methode digitale gegevens van de poten van de ratten na neuronale schade en tijdens zenuwregeneratie, wat bijdraagt aan ons begrip van hoe perifere en centrale zenuwverwondingen hun bewegingsgedrag beïnvloeden. Naast het overwegend gebruikte heupzenuwletselmodel kunnen andere modellen van perifere zenuwletsel zoals de dijbeenzenuw met deze methode worden bestudeerd. Naast verwondingen van het perifere zenuwstelsel kunnen laesies van het centrale zenuwstelsel, bijvoorbeeld, ruggenmergkneuzing worden geëvalueerd. Valide en reproduceerbare gegevensbeoordeling is sterk afhankelijk van een zorgvuldige aanpassing van de hard- en software-instellingen voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Daarnaast is een goede opleiding van de proefdieren van cruciaal belang. Dit werk heeft tot doel het gebruik van geautomatiseerde geautomatiseerde ganganalyse te illustreren om functioneel herstel te beoordelen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel en dwarslaesieletsel. Het benadrukt ook de beperkingen van de methode, bijvoorbeeld, evaluatie van zenuwregeneratie bij ratten met heupzenuwneurotmesis als gevolg van beperkt functioneel herstel. Daarom wordt dit protocol gedacht om onderzoekers die geïnteresseerd zijn in perifere en centrale zenuwverwondingen te helpen om functioneel herstel in knaagdiermodellen te beoordelen.
Verwondingen van het perifere en centrale zenuwstelsel worden vaak bestudeerd bij knaagdieren, wat resulteert in een grote hoeveelheid vergelijkende gegevens over het verloop van zenuwletsel, reparatie of neuroprotectie om verdere secundaire verwondingen en regeneratie1,2,3tegen te gaan . De uitkomst van experimentele behandelingsstrategieën in knaagdiermodellen kan worden beoordeeld aan de hand van verschillende technieken zoals histologie, immunohistochemie, elektrofysiologie en beeldvormingstechnieken zoals röntgenmicrotomografie (μCT) scans, maar het belangrijkste criterium om het succes van een behandeling te bepalen is – zoals bij menselijke patiënten — de mate van functioneel herstel4,5. De eerste studies naar de motorische prestaties bij knaagdieren dateren uit dejaren 40 6,7,8. Ratten en muizen werden onderworpen aan een grote hoeveelheid studies onderzoeken hun motorisch gedrag in de volgende decennia9,10,11. Tegenwoordig bestaat er een breed scala aan beoordelingstechnieken voor knaagdiermodellen van perifere en centrale zenuwletsels, variërend van wandelbaananalyse met inkt en papier12,13,14 over enkel en gang kinematica15,16,17 tot machine learning verbeterde methoden, die het mogelijk maken voor de complexe schatting van gang, ledematen en gewrichtstrajecten18,19.
Geautomatiseerde Automated Gait Analysis (AGA) wordt gebruikt om de motorische functie te evalueren na perifere en centrale zenuwverwondingen en mogelijke experimentele behandeling van dergelijke verwondingen. Het apparaat bestaat voornamelijk uit een glazen loopbrug en een lichtbron die de pootafdrukken van het knaagdier verlicht in correlatie met de druk die door hen wordt overschreden. Deze gegevens worden vervolgens geautomatiseerd om een breed scala aan statische en dynamische parameters te berekenen. Volgens Deumens kunnen deze parameters verder worden onderverdeeld in de categorieën algemene parameters, pijngerelateerde parameters en coördinatiegerelateerde parameters van gang20 (tabel 1). De haalbaarheid van AGA om veranderingen in ganggedrag op te sporen is bewezen in verschillende diermodellen van perifere zenuwletsel (PNI)21, zoals de heupzenuw20, femur zenuw22, en mediane zenuw23,24. Het wordt ook routinematig gebruikt om de motorische functie te beoordelen bij ratten met centrale zenuwverwondingen, bijvoorbeeld beroerte25 of dwarslaesie26. De vooruitgang van de methode ligt in de grote hoeveelheid vergelijkbare gegevens en de mogelijkheid om een overvloed aan parameters met betrekking tot gang27vast te leggen . Dit document heeft tot doel onderzoekers die geïnteresseerd zijn in diermodellen van PNI en dwarslaesie (SCI) te voorzien van een gedetailleerde en hands-on richtlijn om de motorische functie in dergelijke modellen te beoordelen.
Categorie | Parameter | Beschrijving | |
Algemene parameters van de gang | Afdrukgebied (afstandseenheid) | Gebied van de pootafdruk | |
Afdruklengte (afstandseenheid) | Lengte van de pootafdruk | ||
Steunbasis (BoS) (afstandseenheid) | Afstand tussen de twee achter- of voorpoten | ||
Paslengte (afstandseenheid) | Afstand tussen twee opeenvolgende plaatsingen van een poot | ||
Pijngerelateerde parameters van gang | Swing Time (s) | Duur van de swingfase | |
Standtijd (s) | Duur van de houdingsfase | ||
Mean Paw Print Intensiteit (willekeurige eenheid) | Gemiddelde iIntensity van de pootafdruk tijdens de houdingsfase | ||
Coördinatiegerelateerde parameters van de gang | NSSP (Normale stapsequentiepatronen) | Specifieke sequenties van paw plaatsingen tijdens een stapcyclus | |
Fasedispersies (%) | Temporele verschillen tussen de stapcycli van twee specifieke poten | ||
Regelmatigheidsindex (RI) (%) | Kwantificering van interlimb coördinatie door het aantal foutloze NSSP-tijden 4 te delen door het totale aantal paw-plaatsing tijdens één stapcyclus |
Tabel 1: Parameters van gang te beoordelen met de geautomatiseerde ganganalyse. De categorieën waarin de parameters worden ingedeeld, worden gekozen volgens Deumens et al.20.
De beoordeling van functioneel herstel in diermodellen van PNI en SCI blijft een uitdaging vanwege de grote verscheidenheid aan evaluatiemethoden, elk met individuele voor- en nadelen. Slechts weinig benaderingen zijn getest en gevalideerd in meerdere modellen van perifere en centrale zenuwverwondingen, hoewel veelbelovende nieuwe technieken die motion tracking en machine learning combineren neurogedragsonderzoek mogelijk naar het volgende niveau van functionele tests kunnen stuwen. Wij zijn ervan overtuigd dat geavanceerde methoden die breed toepasbaar zijn op een breed scala aan dier- en letselmodellen, binnenkort zullen opduiken. In het licht van deze overwegingen, een van de voordelen van AGA is de mogelijkheid om functioneel herstel te evalueren in meerdere modellen van zenuwletsel met behulp van slechts een apparaat. Sinds het begin van de jaren 2000 wordt deze aanpak gebruikt in experimentele modellen van PNI, zoals de heup37, peroneal38, en femorale zenuwletsel model22 evenals na wortel avulsie van zowel de lenden39 en de brachiale plexus40. Verschillende centrale zenuwletsels, waaronder ruggenmergkneuzing letsel zijn ook onderzocht met de methode41,42. Met dit document presenteerden we een gedetailleerd protocol over hoe we drie vaak bestudeerde zenuwletsels kunnen veroorzaken en hoe we functioneel herstel achteraf kunnen evalueren. Naar onze mening zou een hands-on-richtlijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn op het gebied van experimentele zenuwletsel, reparatie en regeneratie over hoe optimaal gebruik te maken van de voordelige kenmerken van de methode van grote hulp zijn.
Verschillende auteurs hebben het potentieel van AGA aangepakt om functioneel herstel bij knaagdieren te evalueren en wijzen op het voordeel van de methode om tegelijkertijd gangparameters met betrekking tot motorische en zintuiglijke reïnnervatie27,28te beoordelen . Bovendien maakt de vergelijking van gegevens van een experimentele poot, bijvoorbeeld gereconstrueerde zenuwletsel met een niet-geoperated poot, zoals werd aangetoond in beide gepresenteerde modellen, een opname van een intradierpositieve controle mogelijk. Omgekeerd kan een geopereerde poot zonder chirurgische reconstructie of aanvullende behandeling dienen als een intra-dierlijke negatieve controle. Ook werd aangetoond dat het mogelijk is om AGA te combineren met machine learning benaderingen43. Ondanks de voordelen van de methode heeft het ook verschillende beperkingen en nadelen, zoals de tijdrovende trainingsinspanningen, die verplicht zijn om het dier te wennen aan de aankoopprocedure28,44. Een andere beperking van AGA is de maximale grootte van de dieren die voor tests in aanmerking komen vanwege de beperkte afmetingen van het apparaat. Daarom is het gebruik van AGA momenteel beperkt tot dieren ter grootte van knaagdieren en fretten45. Bovendien kunnen onlangs opkomende benaderingen voor neurogedragsbeoordeling op het gebied van motion tracking die in staat zijn om machine learning te ontwikkelen AGA overtreffen in zowel volledigheid als mogelijke toepassingen18,19,46. Meest opmerkelijk, maar in overeenstemming met andere evaluatiemethoden, lijkt het erop dat functioneel herstel zoals beoordeeld door AGA is sterk beperkt-indien zelfs voorkomende-in modellen van heupzenuw neurotmesis47,48. Aan de andere kant, AGA zorgt voor een uitgebreide evaluatie van het verloop van functioneel herstel na femorale zenuw neurotmesis zoals blijkt uit onze gegevens. Met dit werk hebben we aangetoond dat Paw Print Area is een representatieve gang parameter beoordeeld via AGA, die exemplarisch is voor het verloop van functioneel herstel in de twee bovengenoemde perifere zenuwletsel modellen gepresenteerd door ons. Terwijl functioneel herstel ad integrum waarneembaar was na autograft reparatie van de femorale zenuw, werden AGA parameters nog steeds aanzienlijk veranderd van baseline aan het einde van de observatieperiode na autograft reparatie van de heupzenuw. Het is opmerkelijk in deze context dat ledematen contractures zijn een gemeenschappelijk fenomeen bij ratten met heupzenuwletsel en voorzichtigheid is noodzakelijk niet om deze tekenen van spieronbalans en verlamming te verwarren met de procedure functioneel herstel32. Dit aan de ene kant onderstreept het onvermogen van de AGA-methode om significant functioneel herstel na neurotmesisletsel in dit model te detecteren. Aan de andere kant roept het de vraag op of het haalbaar is om het heupzenuwletselmodel van de rat, dat nog steeds het meest gebruikte experimentele zenuwherstelmodel is, te evalueren door middel van loopanalyse in het algemeen voor het geval de zenuwblessure ernstiger is dan axonotmesis48. Gegevens over het oplossen van problemen worden vermeld in aanvullend bestand 1.
We hebben ook voorbeeldige gegevens verstrekt over het gebruik van de methode om de motorische functie bij ratten met dwarslaesie te evalueren, wat mogelijk is zonder dat de hardware-installatie of de aanschafprocedure hoeft te worden gewijzigd. Hetzelfde principe geldt voor andere knaagdiermodellen van centrale zenuwletsel (CNI)26,49,50 en wortelavulsieletsel. In tegenstelling tot geïsoleerde PNO’s zijn verwondingen van het ruggenmerg veel complexer in hun pathofysiologische gevolgen, omdat een veelheid van zeer belangrijke structuren beschadigd zijn, waarbij efferent paden zoals de corticospinale en rubrospinale traktaten en afferent paden zoals de dorsale kolommen en spinothalamische traktaten35. De uitdaging om deze pathologische veranderingen adequaat te beoordelen komt tot uiting in het uitgebreide bewapeningsarium van gedragstests, zoals de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score36. De loopparameter Base of Support is gemeld te verhogen na centrale zenuwverwondingen, waarschijnlijk om rekening te houden met een resulterende instabiele gang. Basis van ondersteuning werd aanzienlijk veranderd van baseline van WPO10 tot WPO14 in ons model, ter ondersteuning van ons vermoeden dat deze parameter het mogelijk maakt de beoordeling van het verloop van functioneel herstel door AGA na thoracale dwarslaesie kneuzing letsel.
Wij zijn ervan overtuigd dat AGA een haalbaar hulpmiddel is om functioneel herstel bij knaagdieren met verwondingen van het zenuwstelsel te evalueren. Toch adviseren wij om de waargenomen veranderingen van gang zorgvuldig en grondig in elke respectieve experimentele setup weer te geven. Wijzigingen in gangparameters, bijvoorbeeld een toename van het afdrukgebied na een onmiddellijke postoperatieve decrementatie of een afname van de swingtijd die een onmiddellijke postoperatieve verhoging van deze parameter in gang stelt, hebben in de loop van de observatieperiode niet onvermijdelijk betrekking op functioneel herstel. In plaats daarvan kunnen deze veranderingen ook worden gerelateerd aan een mogelijke functionele aanpassing om een onopvallende gang te behouden, gezien het feit dat ratten een prooi zijn en proberen te voorkomen dat ze pijn of invaliditeit vertonen aan potentiële roofdieren51. Het wordt daarom aanbevolen om geautomatiseerde ganganalyse te gebruiken als een aanvullend instrument om veranderingen van gang te relateren aan andere uitkomstmaatregelen van perifere zenuwletsel en regeneratie21. Zoals eerder vermeld, zijn we ook van mening dat het zorgvuldig moet worden weerspiegeld als knaagdieren met heupzenuwneurotmesis moeten worden onderzocht door middel van AGA, omdat onze bevinding sterk aangeeft dat functioneel herstel in dit geval ernstig beperkt is.
Zoals blijkt uit ons werk, aga’s belangrijkste troef is de mogelijkheid om zowel motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in een veelheid van experimentele PNI-modellen en CNI, terwijl die slechts een setup. Daarom is de methode naar onze mening een zeer waardevol hulpmiddel voor uitgebreide neurogedragstesten. Een van de activa van AGA, die de mogelijkheid is om motorische en zintuiglijke reinnervatie te bestuderen in verschillende diermodellen van PNI en CNI, terwijl het vereisen van slechts een setup, is naar onze mening het belangrijkste voordeel van de methode in vergelijking met andere evaluatiemethoden om functioneel herstel te bestuderen, zoals walking track analyse52, Von Frey testen53, of gang kinematica16. Het potentieel om tegelijkertijd veranderingen van gang te evalueren die ofwel correleren met de resultaten van elektrofysiologische onderzoeken van gereïnnervateerde spier22 of evaluatiemethoden voor zintuiglijke functie54 is veelbelovend met betrekking tot toekomstige toepassingen van de methode. We raden daarom aan om AGA te gebruiken om functioneel herstel te onderzoeken in knaagdiermodellen van forelimb PNI, zoals de ulnar, radiale of mediane zenuw, of experimentele zenuwoverdrachtmodellen55, die nog niet met deze methode worden onderzocht.
Hierbij bieden we een gedetailleerd protocol over het gebruik van geautomatiseerde ganganalyse om functioneel herstel te bestuderen in drie knaagdiermodellen van zenuwletsel. Hoewel de methode zorgvuldige afweging vereist van verschillende belangrijke aspecten, zoals adequate training en zorgvuldige harde- en softwarekalibratie, is het een haalbaar en waardevol aanvullend hulpmiddel om zenuwregeneratie in knaagdiermodellen van centrale en perifere zenuwletsel te evalueren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Karin Brenner bedanken voor haar gepassioneerde verzorging van de dieren. De auteurs willen ook Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner en Susanne Drechsler bedanken voor hun hulp tijdens de experimentele operaties.
0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat (![]() |
Janvier | N/A | Experimental animal |
Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
Sprague Dawley rat (![]() |
Janvier | N/A | Experimental animal |
Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |