التصوير الخالي من التسميات لديناميكيات تخزين الدهون في Elegans Caenorhabditis باستخدام المجهر التشتت رامان المحفزة
Summary
يسمح الفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS) بالتصوير الانتقائي الخالي من التسميات للمويات الكيميائية المحددة وقد تم استخدامه بشكل فعال لتصوير جزيئات الدهون في الجسم الحي. هنا، ونحن نقدم مقدمة موجزة لمبدأ المجهر SRS ووصف أساليب لاستخدامه في تخزين الدهون التصوير في Elegans Caenorhabditis.
Abstract
استقلاب الدهون هو عملية فسيولوجية أساسية ضرورية لصحة الخلايا والكائنات الحية. خلل تنظيم التمثيل الغذائي للدهون غالبا ما يثير السمنة والعديد من الأمراض المرتبطة بها بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية، ومرض السكري من النوع الثاني، والسرطان. لتعزيز الفهم الحالي لتنظيم التمثيل الغذائي الدهون، أصبحت الأساليب الكمية لقياس بدقة في مستويات تخزين الدهون في الجسم الحي في الزمان والمكان على نحو متزايد مهمة ومفيدة. النهج التقليدية لتحليل تخزين الدهون هي شبه كمية للتقييم المجهري أو تفتقر إلى معلومات الزمانية spatio للقياس الكيميائي الحيوي. التصوير المجهري التشتت رامان (SRS) هو تكنولوجيا التصوير الكيميائي خالية من التسمية التي تمكن الكشف السريع والكمي من الدهون في الخلايا الحية مع قرار subcellular. كما يتم استغلال التباين من الاهتزازات الجزيئية الجوهرية، يسمح الفحص المجهري SRS أيضا تتبع رباعي الأبعاد من الدهون في الحيوانات الحية. في العقد الماضي، تم استخدام المجهر SRS على نطاق واسع لتصوير جزيء صغير في البحوث الطبية الحيوية والتغلب على القيود الرئيسية للتلطيخ الفلوري التقليدي وطرق استخراج الدهون. في المختبر، قمنا بالجمع بين المجهر SRS مع الأدوات الوراثية والبيوكيميائية المتاحة للكائن الحي نموذج قوي، Caenorhabditis elegans، للتحقيق في توزيع وتغايرية قطرات الدهون عبر الخلايا والأنسجة المختلفة، وفي نهاية المطاف لاكتشاف مسارات جديدة الإشارات المحفوظة التي تعدل التمثيل الغذائي للدهون. هنا، نقدم مبادئ العمل والإعداد التفصيلي للمجهر SRS وتوفير أساليب لاستخدامه في تحديد كمي لتخزين الدهون في نقاط زمنية تنموية متميزة من النوع البري والأنسولين مما يشير إلى نقص متحولة C. elegans.
Introduction
أصبحت السمنة مشكلة صحية عالمية تهدد ثلث السكان في جميع أنحاء العالم، وهي تمثل مصدر قلق طبي خطير، نظرا لارتباطها بسوء الصحة العقلية1 والأمراض الفتاكة بما في ذلك مرض السكري2وأمراض القلب والأوعية الدموية3 وبعض أنواع السرطان4. دراسة التمثيل الغذائي للدهون أمر ضروري لفهم أفضل للمشاكل البيولوجية وراء السمنة. كمية سريعة ومحددة لتخزين الدهون ينطوي على الكشف عن الأحماض الدهنية ومشتقاتها، وكذلك المستقلبات التي تحتوي على ستيرول، مع حساسية عالية ويفضل مع المعلومات المكانية. الدهون هي أهداف صعبة للصورة لأنها تفتقر إلى الفلورسنت الجوهرية ولا يمكن تمييزها بسهولة الفلورسنت. غالبا ما تكون علامات الفلورسنت أكبر من جزيئات الدهون ، وبالتالي ، يمكن أن تكون غازية كيميائيا وغير عملية في تطبيقات الجسم الحي. استراتيجية وضع العلامات خالية من التسمية أو الحد الأدنى ضروري للحفاظ على بنية مسعورة من جزيئات الدهون5. خلقت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير فرصا مثيرة للتصوير الخالي من الملصقات للدهون في الخلايا الحية والأنسجة والكائنات الحية.
وتشمل النهج التقليدية لتحليلات تخزين الدهون في العينات البيولوجية المقايسات الكيميائية الحيوية وبروتوكولات تلطيخ مع الأصباغ الدهنية. إن المقايسات البيوكيميائية للقياس الكمي التي تنطوي على قياس الطيف الكتلي (MS) لا مثيل لها في قابليتها للحل الجزيئي ، ولكنها تتطلب كميات كبيرة جدا من العينات وعادة ما يستغرق إعداد العينة عدة ساعات ، مما يحد من تطبيقها للتصوير في الوقت الحقيقي للأنظمة الحية5. وثمة قيد رئيسي آخر لهذه المقايسات هو الافتقار إلى المعلومات المكانية. من ناحية أخرى، الأصباغ الدهنية مثل النفط الأحمر O والسودان الأسود توفير الأنسجة والتوزيع الخلوي من العضيات تخزين الدهون وبالمقارنة مع تقنيات التصلب العصبي المتعدد، وهذه الأساليب تلطيخ هي أيضا منخفضة في التكلفة وسهلة الأداء. ومع ذلك ، تتطلب بروتوكولات التلطيخ هذه التثبيت ، والتي يمكن أن تؤثر على الطبيعة الكارهة للماء لقطرات الدهون ، وتولد تغييرات اصطناعية في بنيتها وتؤدي إلى عدم اتساق بين التجارب6. وقد أدت الصعوبات التقنية المرتبطة بالتقنيات الكيميائية الحيوية والتلطيخ إلى البحث عن طرق خالية من الملصقات لتصوير جزيئات الدهون والزيادة السريعة في استخدام المجهر المتماسك لتشتت رامان (CRS) في تصوير الدهون.
تم التعرف على تأثير رامان لأول مرة من قبل رامان وكريشان ، حيث أفادوا أنه عند التفاعل مع الفوتون ، يمكن للجزيء توليد ضوء متناثر دون أي تغيير في الطول الموجي (يسمى تشتت رايلي) أو نادرا ما يكون مع طول موجي متغير (يسمى تشتت رامان) وهذا التغيير في الطول الموجي هو سمة من سمات المجموعات الكيميائية الوظيفية داخل الجزيء7. عندما تتحمس الروابط الكيميائية داخل جزيء إلى مستوى طاقة اهتزازي أعلى من خلال فوتون حادث ، يسمى فوتون المضخة ، تصبح طاقة الفوتون المتناثر ، المسمى فوتون ستوكس ، أقل. خلاف ذلك ، يمكن أن تصل الروابط الكيميائية إلى مستوى طاقة اهتزازي أقل إذا كانت في الأصل على مستوى أعلى ، واكتساب الفوتون المتناثر للطاقة ليكون الفوتون المضاد لست ستوكس. ويعرف فرق التردد بين الحادث والفوتونات المتناثرة باسم تحول رامان. كل رابطة كيميائية داخل جزيء لديه تحول رامان مميزة وقابلة للقياس الكمي. على سبيل المثال، السندات CH2 لديه تحول رامان من 2845 سم-1،وهو وفير في سلاسل الأحماض الدهنية8. هذه الإشارة رامان عفوية ضعيفة جدا عموما، والتي حدت إلى حد كبير من سرعة التصوير في المجهر رامان عفوية التقليدية. على مر السنين، تم تطوير نهج مختلفة لزيادة سرعة التصوير وحساسية الفحص الدقيق رامان عفوية. متماسكة رامان تشتت المجهر ، بما في ذلك متماسكة المضادة ستوكس رامان التشتت (سيارات) المجهر وتحفيز رامان التشتت (SRS) المجهر ، هو أحدث تقدم. السيارات وSRS لديها مبادئ عمل مختلفة قليلا، ولكن كلاهما تقنيات خالية من التسمية التي لديها القدرة على التصوير الحي، يمكن أن تسفر عن معلومات مكانية وزمنية على ديناميات تخزين الدهون، وتتطلب فقط حجم عينة صغيرة. السيارات المجهر يعاني من خلفية غير رنانة، والتي تأتي من مختلف العمليات غير الخطية، وإشارات سيارات لديها أيضا علاقة غير خطية مع تركيز الجزيء، والتي تعقد معا عملية القياس الكمي9. على عكس المجهر CARS، لا يولد المجهر SRS إشارات خلفية غير رنانة ويوفر الاعتماد الخطي على تركيز جزيء الفائدة. وهكذا، يستخدم حاليا المجهر SRS على نطاق أوسع لتصوير الدهون.
في المجهر SRS، يمكن تضخيم إشارات رامان عفوية ضعيفة عندما متحمس من قبل اثنين من أشعة الليزر متزامنة مع اختلاف التردد مطابقة تردد اهتزاز السندات الكيميائية. سوف يشهد الجزيء انتقالا معززا إلى حالة متحمسة بسبب الإثارة المتماسكة. ونتيجة لذلك ، يتم تعزيز معدل توليد الفوتون ستوكس. وبالتالي، تزداد كثافة شعاع “ستوكس” المنقول (كسب رامان المحفز، SRG) وتنخفض كثافة شعاع “المضخة” المنقول (فقدان رامان المحفز، SRL). الكشف عن إشارات SRG أو SRL يكمن وراء الأساس لتحفيز رامان التشتت (SRS) التصوير المجهري للجزيئات مع روابط كيميائية محددة10. إذا كان اختلاف التردد بين شعاعي الليزر لا يطابق التردد الاهتزازي للرابط الكيميائي داخل جزيء مهم، فلن يتم توليد إشارات SRG أو SRL. سرعة التصوير من المجهر SRS حوالي 2 ميكروثانية لكل بكسل أو 1 ثانية لكل إطار، وهو أسرع بكثير من المجهر رامان عفوية11. الدقة الجانبية النموذجية للفحص المجهري SRS محدودة الحيود وحوالي 300 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح العمليات البصرية ذات الفوتونين من المجهر SRS بالتصوير ثلاثي الأبعاد الحجم لعينات الأنسجة السميكة النسبية ويمكن أن يصل عمق التصوير إلى 300-500 ميكرومتر. وعموما، يقدم المجهر SRS تقنية تصوير فعالة وخالية من الملصقات للكشف عن الجزيئات الحيوية المحددة، وخاصة الدهون.
قطرات الدهون هي العضيات ذات الغشاء الواحد، والتي هي موقع التخزين الخلوي الرئيسي للدهون المحايدة، بما في ذلك ثلاثيات اللجلس (TAGs) وإسترات الكوليسترول (CEs). CH2 السندات في سلاسل الأحماض الدهنية من هذه الجزيئات الدهنية توليد إشارات SRS قوية في 2,845 سم-1 عندما متحمس8,وبالتالي تمكين الكشف عن وتكميم مستويات الدهون التخزين في الخلايا سليمة, أقسام الأنسجة وحتى الكائنات الحية كلها12,13,14,15. على وجه الخصوص ، C. elegans مفيدة لدراسات التصوير الدهني بسبب شفافيتها. مثل الثدييات، C. elegans أيضا تخزين الدهون في قطرات الدهون ومسارات التوليف والتدهور من جزيئات الدهون يتم الحفاظ عليها للغاية16. في هذا البروتوكول، وسوف نقدم مبدأ العمل من المجهر SRS، الإعداد الأساسي ووصف أساليب استخدامه في التصوير الدهون في C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدفاع ضد السمنة والاضطرابات الأيضية المرتبطة بها، تم تنفيذ جهود بحثية هامة لفهم أفضل للآليات التنظيمية للداء المنزلي الدهني. للكشف الكمي لجزيئات الدهون في العينات البيولوجية، ثبت أن التصوير الخالي من الملصقات بواسطة المجهر SRS هو بديل موثوق به للمقاايسات الكيميائية الحيوية وغيرها من…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01AG045183 (M.C.W.) وR01AT009050 (M.C.W.) وR01AG062257 (M.C.W. (1) DP1DK13644 (M.C.W.)، وآذار/مارس لمؤسسة دايمز (M.C.W.)، ومؤسسة ويلش (M.C.W.)، ومحقق HHMI (M.C.W.). نشكر مركز علم الوراثة في كاينورهابديتس (CGC) على سلالات سي إليغانس.
Materials
| A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
| Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
| Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
| Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
| Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
| Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
| BNC cables | |||
| Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
| Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
| Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
| General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
| Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
| Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
| Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
| Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
| Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
| Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
- Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
- Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
- Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
- Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
- Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
- Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
- Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
- Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
- Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
- Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
- Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
- Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
- Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
- Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
- Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Génétique. 207 (2), 413-446 (2017).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
- Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
- Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Génétique. 201 (2), 613-629 (2015).
- Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
- Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
- Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
- Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
- Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
- Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
- Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
- Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
- Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
- Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
- Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
- Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).
