Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Summary

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ermöglicht eine selektive, markierungsfreie Abbildung bestimmter chemischer Bestandteile und wurde effektiv zur Abbildung von Lipidmolekülen in vivo eingesetzt. Hier geben wir eine kurze Einführung in das Prinzip der SRS-Mikroskopie und beschreiben Methoden zu deren Einsatz bei der bildgebenden Lipidspeicherung bei Caenorhabditis elegans.

Abstract

Der Fettstoffwechsel ist ein grundlegender physiologischer Prozess, der für die Gesundheit von Zellen und Organismen notwendig ist. Eine Dysregulation des Fettstoffwechsels löst oft Fettleibigkeit und viele damit verbundene Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-II-Diabetes und Krebs aus. Um das aktuelle Verständnis der Lipidmetabolregulation voranzutreiben, sind quantitative Methoden zur präzisen Messung der In-vivo-Lipidspeicher in Zeit und Raum immer wichtiger und nützlicher geworden. Herkömmliche Ansätze zur Analyse der Lipidspeicherung sind semi-quantitativ für die mikroskopische Beurteilung oder es fehlen räumlich-zeitliche Informationen für biochemische Messungen. Die stimulierte Raman-Streuung (SRS)-Mikroskopie ist eine markierungsfreie chemische Bildgebungstechnologie, die einen schnellen und quantitativen Nachweis von Lipiden in lebenden Zellen mit subzellulärer Auflösung ermöglicht. Da der Kontrast durch intrinsische molekulare Schwingungen ausgenutzt wird, ermöglicht die SRS-Mikroskopie auch die vierdimensionale Verfolgung von Lipiden bei lebenden Tieren. In den letzten zehn Jahren wurde die SRS-Mikroskopie häufig für die Bildgebung kleiner Moleküle in der biomedizinischen Forschung eingesetzt und überwand die großen Einschränkungen herkömmlicher fluoreszierender Färbe- und Lipidextraktionsmethoden. Im Labor haben wir die SRS-Mikroskopie mit den genetischen und biochemischen Werkzeugen kombiniert, die dem leistungsstarken Modellorganismus Caenorhabditis elegans zur Verfügung stehen, um die Verteilung und Heterogenität von Lipidtröpfchen über verschiedene Zellen und Gewebe hinweg zu untersuchen und schließlich neue konservierte Signalwege zu entdecken, die den Fettstoffwechsel modulieren. Hier stellen wir die Arbeitsprinzipien und den detaillierten Aufbau des SRS-Mikroskops vor und stellen Methoden für seine Verwendung zur Quantifizierung der Lipidspeicherung zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten der Wildtyp- und Insulinsignalisierung der mangelhaften Mutante C. eleganszur Verfügung.

Introduction

Fettleibigkeit ist zu^einem globalen Gesundheitsproblem geworden, das ein Drittel der Bevölkerung auf der ganzen Welt bedroht, und es stellt ein ernstes medizinisches Problem dar, da es mit schlechter psychischer Gesundheit 1 und tödlichen Krankheiten wie Diabetes^2,Herz-Kreislauf-Erkrankungen³ und einigen Krebsarten^{4 in}Verbindung steht. Das Studium des Fettstoffwechsels ist unerlässlich, um die biologischen Probleme hinter Fettleibigkeit besser zu verstehen. Die schnelle und spezifische Quantifizierung der Lipidspeicherung beinhaltet den Nachweis von Fettsäuren und deren Derivaten sowie sterolhaltigen Metaboliten mit hoher Sensitivität und vorzugsweise mit räumlichen Informationen. Lipide sind schwierige Ziele, da sie keine intrinsische Fluoreszenz haben und nicht leicht fluoreszierend markiert werden können. Die fluoreszierenden Tags sind oft größer als die Lipidmoleküle und können daher chemisch invasiv und für In-vivo-Anwendungen unpraktisch sein. Eine markierungsfreie oder minimale Markierungsstrategie ist notwendig, um die hydrophobe Struktur der Lipidmoleküle zu erhalten⁵. Jüngste Entwicklungen in der Bildgebung haben aufregende Möglichkeiten für die markierungsfreie Bildgebung von Lipiden in lebenden Zellen, Geweben und Organismen geschaffen.

Traditionelle Ansätze für Lipidspeicheranalysen in biologischen Proben umfassen biochemische Assays und Färbeprotokolle mit lipophilen Farbstoffen. Biochemische Quantifizierungsassays mit Massenspektrometrie (MS) sind in ihrer molekularen Auflösungsfähigkeit unübertroffen, erfordern jedoch sehr große Probenmengen und die Probenvorbereitung dauert in der Regel mehrere Stunden, was ihre Anwendung für die Echtzeitbildgebung lebender Systeme einschränkt⁵. Eine weitere große Einschränkung dieser Assays ist der Mangel an räumlichen Informationen. Auf der anderen Seite sorgen lipophile Farbstoffe wie Oil Red O und Sudan Black für die Gewebe- und Zellverteilung von Lipidspeicherorganellen und im Vergleich zu MS-Techniken sind diese Färbemethoden auch kostengünstig und einfach durchzuführen. Diese Färbeprotokolle erfordern jedoch eine Fixierung, die sich auf die hydrophobe Natur der Lipidtröpfchen auswirken, künstliche Veränderungen in ihrer Struktur erzeugen und zu Inkonsistenzen zwischen den Experimenten führen kann⁶. Die technischen Schwierigkeiten, die mit biochemischen und Färbetechniken verbunden sind, haben zur Suche nach markierungsfreien Methoden zur Abbildung von Lipidmolekülen und zu einer raschen Zunahme der Verwendung kohärenter Raman-Streumikroskopie (CRS) in der Lipidbildgebung geführt.

Der Raman-Effekt wurde zuerst von Raman und Krishnan erkannt, wo sie berichteten, dass ein Molekül bei der Wechselwirkung mit einem Photon gestreutes Licht ohne Änderung der Wellenlänge (Rayleigh-Streuung genannt) oder selten mit einer veränderten Wellenlänge (Raman-Streuung genannt) erzeugen kann, und diese Änderung der Wellenlänge ist charakteristisch für die funktionellen chemischen Gruppen innerhalb des^{Moleküls 7}. Wenn die chemischen Bindungen innerhalb eines Moleküls durch ein einfallendem Photon, das als Pumpphoton bezeichnet wird, auf ein höheres Schwingungsenergieniveau angeregt werden, wird die Energie des gestreuten Photons, das Stokes-Photon genannt, niedriger. Andernfalls können die chemischen Bindungen ein niedrigeres Schwingungsenergieniveau erreichen, wenn sie sich ursprünglich auf einem höheren Niveau befinden, und das gestreute Photon gewinnt Energie, um das Anti-Stokes-Photon zu sein. Der Frequenzunterschied zwischen den einfallenden und gestreuten Photonen wird als Raman-Verschiebung bezeichnet. Jede chemische Bindung innerhalb eines Moleküls hat eine charakteristische und quantifizierbare Raman-Verschiebung. Zum Beispiel hat die_CH2-Bindung eine Raman-Verschiebung von 2.845 cm^-1, die in Fettsäureketten reichlich vorhanden ist⁸. Dieses spontane Raman-Signal ist im Allgemeinen sehr schwach, was die Bildgebungsgeschwindigkeit in der herkömmlichen spontanen Raman-Mikroskopie stark eingeschränkt hat. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die Bildgebungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit der spontanen Raman-Mikroskopie zu erhöhen. Die kohärente Raman-Streumikroskopie, einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie, ist der jüngste Fortschritt. CARS und SRS haben leicht unterschiedliche Arbeitsprinzipien, aber beide sind markierungsfreie Techniken, die Live-Imaging-Fähigkeit haben, räumliche und zeitliche Informationen über die Dynamik der Lipidspeicherung liefern können und nur eine kleine Stichprobengröße erfordern. Die CARS-Mikroskopie leidet unter einem nicht-resonanten Hintergrund, der von verschiedenen nichtlinearen Prozessen herrgeht, und CARS-Signale haben auch eine nichtlineare Beziehung zur Molekülkonzentration, was zusammen den Quantifizierungsprozess erschwert⁹. Im Gegensatz zur CARS-Mikroskopie erzeugt die SRS-Mikroskopie keine nicht-resonanten Hintergrundsignale und bietet eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration des interessierenden Moleküls. Daher wird die SRS-Mikroskopie derzeit häufiger für die Lipidbildgebung eingesetzt.

In der SRS-Mikroskopie können die schwachen spontanen Raman-Signale verstärkt werden, wenn sie von zwei synchronisierten Laserstrahlen angeregt werden, deren Frequenzdifferenz mit der Schwingungsfrequenz der chemischen Bindung übereinstimmt. Das Molekül wird aufgrund kohärenter Anregung einen verstärkten Übergang in einen angeregten Zustand erfahren. Infolgedessen wird die Rate der Stokes-Photonenerzeugung erhöht. Folglich nimmt die Intensität des übertragenen “Stokes”-Strahls zu (stimulierte Raman-Verstärkung, SRG) und die Intensität des übertragenen “Pump”-Strahls ab (stimulierter Raman-Verlust, SRL). Die Detektion von SRG- oder SRL-Signalen liegt der Grundlage für die mikroskopische Bildgebung von Molekülen mit spezifischen chemischen Bindungen (SRS)¹⁰zugrunde. Stimmt die Frequenzdifferenz zwischen den beiden Laserstrahlen nicht mit der Schwingungsfrequenz der chemischen Bindung innerhalb eines interessierenden Moleküls überein, werden weder SRG- noch SRL-Signale erzeugt. Die Bildgeschwindigkeit der SRS-Mikroskopie liegt bei etwa 2 μsec pro Pixel oder 1 Sekunde pro Bild, was viel schneller ist als die spontane Raman-Mikroskopie^11. Typische laterale Auflösung für die SRS-Mikroskopie ist beugungsbegrenet und um die 300 nm. Darüber hinaus ermöglichen die optischen Zwei-Photonen-Verfahren der SRS-Mikroskopie eine volumetrische 3D-Bildgebung von relativ dicken Gewebeproben und die Bildtiefe könnte 300-500 μm erreichen. Insgesamt stellt die SRS-Mikroskopie eine effiziente, markierungsfreie Bildgebungstechnik dar, um spezifische Biomoleküle, insbesondere Lipide, nachzuweisen.

Lipidtröpfchen sind Einmembranorganellen, die die Hauptspeicherstelle für neutrale Lipide sind, einschließlich der Triacylglycerole (TAGs) und Cholesterinester (CEs). CH2-Bindungen in den Fettsäureketten dieser Lipidmoleküle erzeugen starke SRS-Signale bei 2.845 cm^-1, wenn sie⁸angeregt werden, wodurch der Nachweis und die Quantifizierung von Speicherlipidspiegeln in intakten Zellen, Gewebeabschnitten und sogar ganzen Organismen ermöglicht^{wird 12,13,14,15}. Insbesondere C. elegans sind aufgrund ihrer Transparenz für Lipidbildgebungsstudien nützlich. Wie Säugetiere speichert auch C. elegans Lipide in Lipidtröpfchen und die Synthese- und Abbauwege von Lipidmolekülen sind hoch konserviert¹⁶. In diesem Protokoll werden wir das Funktionsprinzip der SRS-Mikroskopie, ihren grundlegenden Aufbau und die Methoden für ihre Verwendung in der Lipidbildgebung in C. elegansbeschreiben.

Protocol

1. Instrumenteller Aufbau für stimulierte Raman-Streumikroskopie HINWEIS: Das SRS-Mikroskopiesystem basiert auf einem Pikosekundenlaser mit pumpenintegriertem optischem parametrischem Oszillator und einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Der Oszillator liefert zwei Pikosekunden-Pulszüge, darunter einen Stokes-Strahl bei 1.064 nm und einen Pumpstrahl, der zwischen 700 und 990 nm abstimmbar ist. Zeitliche und räumliche Überlappungen der beiden Strahlen werden im Inneren des Lasers erreicht….

Representative Results

Insulinsignalisierung ist ein wichtiger endokriner Weg, der Entwicklung, Fortpflanzung, Lebensdauer und Stoffwechsel beeinflusst. Bei Würmern besteht die Insulinsignalisierung aus etwa 40 insulinähnlichen Peptidliganden, insulinähnlichen Wachstumsfaktorrezeptororthologe DAF-2, nachgeschalteter PI3K/AKT-Kinasekaskade und dem FoxO-Transkriptionsfaktor-Ortholog, DAF-1620. daf-2 Mutanten, denen der Insulinrezeptor fehlt, haben mehr Lipidtröpfchen in ihrem Darm, das Wurmlipidspeichergewebe…

Discussion

Zur Abwehr von Fettleibigkeit und den damit verbundenen Stoffwechselstörungen wurden wichtige Forschungsanstrengungen unternommen, um die Regulationsmechanismen der Lipidöostase besser zu verstehen. Für den quantitativen Nachweis von Lipidmolekülen in biologischen Proben hat sich die markierungsfreie Bildgebung mittels SRS-Mikroskopie als zuverlässige Alternative zu biochemischen Assays und anderen Färbemethoden erwiesen. Unsere Gruppe und andere haben neue biologische Mechanismen in der Lipidstoffwechselregulation…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP