Etikettfri bildebehandling av Lipidlagringsdynamikk i Caenorhabditis elegans ved hjelp av stimulert Raman Scattering Microscopy

Summary

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi tillater selektiv, etikettfri avbildning av spesifikke kjemiske moieties, og det har effektivt blitt brukt til å bilde lipidmolekyler in vivo. Her gir vi en kort introduksjon til prinsippet om SRS-mikroskopi og beskriver metoder for bruk i avbildning av lipidlagring i Caenorhabditis elegans.

Abstract

Lipidmetabolisme er en grunnleggende fysiologisk prosess som er nødvendig for cellulær og organismehelse. Dysregulering av lipidmetabolisme fremkaller ofte fedme og mange tilknyttede sykdommer, inkludert kardiovaskulære lidelser, type II diabetes og kreft. For å fremme den nåværende forståelsen av lipid metabolsk regulering, kvantitative metoder for å nøyaktig måle in vivo lipid lagringsnivåer i tid og rom har blitt stadig viktigere og nyttig. Tradisjonelle tilnærminger for å analysere lipidlagring er semi-kvantitative for mikroskopisk vurdering eller mangler romlig-temporal informasjon for biokjemisk måling. Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en etikettfri kjemisk bildeteknologi som muliggjør rask og kvantitativ deteksjon av lipider i levende celler med subcellulær oppløsning. Ettersom kontrasten utnyttes av indre molekylære vibrasjoner, tillater SRS-mikroskopi også firedimensjonal sporing av lipider hos levende dyr. I løpet av det siste tiåret har SRS-mikroskopi blitt mye brukt til små molekylavbildninger i biomedisinsk forskning og overvinne de store begrensningene ved konvensjonelle fluorescerende fargings- og lipidutvinningsmetoder. I laboratoriet har vi kombinert SRS-mikroskopi med de genetiske og biokjemiske verktøyene som er tilgjengelige for den kraftige modellorganismen, Caenorhabditis elegans, for å undersøke fordelingen og heterogeniteten til lipiddråper på tvers av forskjellige celler og vev og til slutt oppdage nye bevarte signalveier som modulerer lipidmetabolismen. Her presenterer vi arbeidsprinsippene og det detaljerte oppsettet av SRS-mikroskopet og gir metoder for bruk i kvantifisering av lipidlagring ved distinkte utviklingstidspunkter av villtype og insulinsignalering mangelfull mutant C. elegans.

Introduction

Fedme har blitt et globalt helseproblem som truer en tredjedel av befolkningen rundt om i verden, og det presenterer en alvorlig medisinsk bekymring, gitt sin tilknytning til dårlig psykisk helse¹ og dødelige sykdommer, inkludert diabetes², kardiovaskulære sykdommer³ og noen typer kreft⁴. Studie av lipidmetabolisme er viktig for å bedre forstå de biologiske problemene bak fedme. Rask og spesifikk kvantifisering av lipidlagring innebærer påvisning av fettsyrer og deres derivater, samt sterolholdige metabolitter, med høy følsomhet og helst med romlig informasjon. Lipider er utfordrende mål å bilde fordi de mangler egen fluorescens og kan ikke lett fluorescerende merket. De fluorescerende kodene er ofte større enn lipidmolekylene, og kan derfor være kjemisk invasive og upraktiske for in vivo-applikasjoner. Etikettfri eller minimal merkingsstrategi er nødvendig for å bevare den hydrofobe strukturen til lipidmolekylene⁵. Den siste tidens utvikling innen bildeteknologi har skapt spennende muligheter for etikettfri avbildning av lipider i levende celler, vev og organismer.

Tradisjonelle tilnærminger for lipidlagringsanalyser i biologiske prøver inkluderer biokjemiske analyser og fargingsprotokoller med lipofile fargestoffer. Biokjemiske kvantifiseringsanalyser som involverer massespektrometri (MS) er uovertruffen i deres molekylære løsbarhet, men de krever svært store prøvemengder, og prøvepreparering tar vanligvis flere timer, noe som begrenser søknaden om sanntidsavbildning av levende systemer⁵. En annen stor begrensning ved disse analysene er mangelen på romlig informasjon. På den annen side gir lipofile fargestoffer som Oil Red O og Sudan Black vev og cellulær distribusjon av lipidlagringsorganeller, og sammenlignet med MS-teknikker er disse fargingsmetodene også lave i pris og enkle å utføre. Imidlertid krever disse fargingsprotokollene fiksering, noe som kan påvirke lipiddråpens hydrofobe natur, generere kunstige endringer i strukturen og resultere i inkonsekvenser mellom eksperimenter⁶. De tekniske vanskelighetene forbundet med biokjemiske og fargingsteknikker har ført til søket etter etikettfrie metoder for å bilde lipidmolekyler og til den raske økningen i bruken av sammenhengende Raman-spredning (CRS) mikroskopi i lipidavbildning.

Raman-effekten ble først anerkjent av Raman og Krishnan, hvor de rapporterte at ved interaksjon med en foton kan et molekyl generere spredt lys uten endring i bølgelengde (kalt Rayleigh-spredning) eller sjelden med en endret bølgelengde (kalt Raman-spredning), og denne endringen i bølgelengde er karakteristisk for de funksjonelle kjemiske gruppene i^{molekylet 7}. Når de kjemiske bindingene i et molekyl blir begeistret for et høyere vibrasjonsenerginivå av en hendelse foton, kalt pumpefoton, blir energien til den spredte fotonen, kalt Stokes photon, lavere. Ellers kan de kjemiske bindingene nå et lavere vibrasjonsenerginivå hvis de opprinnelig er på et høyere nivå, og den spredte fotonen får energi til å være anti-Stokes foton. Frekvensforskjellen mellom hendelsen og spredte fotoner er kjent som Raman-skiftet. Hver kjemisk binding i et molekyl har et karakteristisk og kvantifiserbart Raman-skift. For eksempel har CH_2-bindingen et Raman-skifte på 2845 cm^-1, som er rikelig i fettsyrekjeder⁸. Dette spontane Raman-signalet er generelt veldig svakt, noe som i stor grad har begrenset bildehastigheten i konvensjonell spontan Raman-mikroskopi. Gjennom årene har ulike tilnærminger blitt utviklet for å øke bildehastigheten og følsomheten til spontan Raman-mikroskopi. Sammenhengende Raman spredning mikroskopi, inkludert sammenhengende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) mikroskopi og Stimulert Raman Scattering (SRS) mikroskopi, er den nyeste fremgangen. CARS og SRS har litt forskjellige arbeidsprinsipper, men begge er etikettfrie teknikker som har live avbildningsevne, kan gi romlig og tidsmessig informasjon om lipidlagringsdynamikk, og krever bare liten prøvestørrelse. CARS mikroskopi lider av ikke-resonansbakgrunn, som kommer fra ulike ikke-lineære prosesser, og CARS-signaler har også ikke-lineær forhold til molekylkonsentrasjonen, som sammen kompliserer kvantifiseringsprosessen⁹. I motsetning til CARS mikroskopi genererer SRS-mikroskopi ikke ikke-resonante bakgrunnssignaler og tilbyr lineær avhengighet av konsentrasjonen av interessemolekylet. Dermed er for tiden SRS-mikroskopi mer brukt til lipidavbildning.

Ved SRS-mikroskopi kan de svake spontane Raman-signalene forsterkes når de forsterkes av to synkroniserte laserstråler med frekvensforskjellen som samsvarer med vibrasjonsfrekvensen for kjemisk binding. Molekylet vil oppleve en forbedret overgang til en spent tilstand på grunn av sammenhengende eksitasjon. Som et resultat økes frekvensen av Stokes fotongenerasjon. Følgelig øker intensiteten til den overførte “Stokes” strålen (stimulert Raman gain, SRG) og intensiteten til den overførte “pumpe” strålen minker (stimulert Raman tap, SRL). Påvisning av SRG- eller SRL-signaler ligger til grunn for SRS-mikroskopiavbildning av molekyler med spesifikke kjemiske bindinger¹⁰. Hvis frekvensforskjellen mellom de to laserstrålene ikke samsvarer med vibrasjonsfrekvensen til den kjemiske bindingen innenfor et molekyl av interesse, vil verken SRG- eller SRL-signaler bli generert. Bildehastigheten til SRS-mikroskopi er rundt 2 μsec per piksel eller 1 sekund per ramme, noe som er mye raskere enn spontan Raman-mikroskopi¹¹. Typisk lateral oppløsning for SRS mikroskopi er diffraksjon begrenset og rundt 300 nm. I tillegg tillater de to-foton optiske prosessene til SRS-mikroskopi volumetrisk 3D-avbildning av relative tykke vevsprøver, og bildedybden kan nå 300-500 μm. Totalt sett presenterer SRS-mikroskopi en effektiv, etikettfri bildeteknikk for å oppdage spesifikke biomolekyler, spesielt lipider.

Lipiddråper er enkeltmembranorganeller, som er det viktigste cellulære lagringsstedet for nøytrale lipider, inkludert triacylglyseroler (TAG) og kolesterolestere (CE). CH_2-bindinger i fettsyrekjedene til disse lipidmolekylene genererer sterke SRS-signaler på 2845 cm^-1 når de er begeistret⁸, og muliggjør dermed deteksjon og kvantifisering av lagringslipidnivåer i intakte celler, vevsseksjoner og til og med hele organismer^12,13,14,15. Spesielt er C. elegans nyttige for lipidavbildningsstudier på grunn av deres gjennomsiktighet. Som pattedyr lagrer C. elegans også lipider i lipiddråper, og syntesen og nedbrytningsveiene til lipidmolekyler er høyt bevart¹⁶. I denne protokollen vil vi gi arbeidsprinsippet for SRS-mikroskopi, det grunnleggende oppsettet og beskrive metodene for bruk i lipidavbildning i C. elegans.

Protocol

1. Instrumental oppsett for stimulert Raman scattering mikroskopi MERK: SRS-mikroskopisystemet er bygget på en picosecond-laser med pumpeintegrert optisk parametrisk oscillator og et konfokalt laserskanningsmikroskop. Oscillatoren gir to picosecond pulstog, inkludert en Stokes-stråle på 1064 nm og en pumpestråle som kan justeres mellom 700 og 990 nm. Tidsmessig og romlig overlapping av de to bjelkene oppnås inne i laseren. En innebygd elektrooptisk modulator (EOM) er designet spesielt for S…

Representative Results

Insulinsignalering er en viktig endokrine vei som påvirker utvikling, reproduksjon, levetid og metabolisme. I ormer består insulinsignalering av ca. 40 insulinlignende peptidligaler, insulinlignende vekstfaktorreseptor ortolog DAF-2, nedstrøms PI3K/AKT kinase kaskade og FoxO transkripsjonsfaktor ortholog, DAF-1620. daf-2 mutanter, som mangler insulinreseptoren, har flere lipiddråper i tarmen, ormen lipid lagringsvev21,22. Ved …

Discussion

Til forsvar mot fedme og tilhørende metabolske forstyrrelser, har viktig forskningsinnsats blitt implementert for bedre å forstå reguleringsmekanismene til lipid homeostase. For kvantitativ deteksjon av lipidmolekyler i biologiske prøver har etikettfri avbildning av SRS-mikroskopi vist seg å være et pålitelig alternativ til biokjemiske analyser og andre fargingsmetoder. Vår gruppe og andre har avslørt nye biologiske mekanismer i lipid metabolsk regulering ved å kombinere bruk av C. elegans og SRS mikro…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP