Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Summary

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Abstract

O metabolismo lipídico é um processo fisiológico fundamental necessário para a saúde celular e do organismo. A desregulação do metabolismo lipídico muitas vezes provoca obesidade e muitas doenças associadas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes tipo II e câncer. Para avançar no entendimento atual da regulação metabólica lipídica, os métodos quantitativos para medir precisamente os níveis de armazenamento lipídóide in vivo no tempo e no espaço tornaram-se cada vez mais importantes e úteis. As abordagens tradicionais para analisar o armazenamento lipídico são semi-quantitativas para avaliação microscópica ou falta de informações diarrecenciais para medição bioquímica. A microscopia de dispersão Raman estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de rótulos que permite a detecção rápida e quantitativa de lipídios em células vivas com resolução subcelular. Como o contraste é explorado a partir de vibrações moleculares intrínsecas, a microscopia SRS também permite o rastreamento quadridimensional de lipídios em animais vivos. Na última década, a microscopia SRS tem sido amplamente utilizada para imagens de pequenas moléculas em pesquisas biomédicas e superar as principais limitações dos métodos convencionais de coloração fluorescente e extração lipídica. Em laboratório, combinamos microscopia srs com as ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para o poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar a distribuição e heterogeneidade de gotículas lipídicas em diferentes células e tecidos e, finalmente, descobrir novas vias de sinalização conservadas que modulam o metabolismo lipídico. Aqui, apresentamos os princípios de trabalho e a configuração detalhada do microscópio SRS e fornecemos métodos para seu uso na quantificação do armazenamento lipídico em pontos de tempo distintos de desenvolvimento de tipo selvagem e insulina sinalizando mutantes deficientes C. elegans.

Introduction

A obesidade tornou-se um problema de saúde global que ameaça um terço da população em todo o mundo, e apresenta uma séria preocupação médica, dada a sua associação com a saúde mental ruim¹ e doenças mortais, incluindo diabetes², doenças cardiovasculares³ e alguns tipos de câncer⁴. O estudo do metabolismo lipídico é essencial para entender melhor os problemas biológicos por trás da obesidade. A quantificação rápida e específica do armazenamento lipídico implica a detecção de ácidos graxos e seus derivados, bem como metabólitos contendo esterol, com alta sensibilidade e preferencialmente com informações espaciais. Lipídios são alvos desafiadores para a imagem porque não têm fluorescência intrínseca e não podem ser facilmente marcados fluorescentemente. As etiquetas fluorescentes são muitas vezes maiores que as moléculas lipídicas e, portanto, podem ser quimicamente invasivas e impraticáveis para aplicações in vivo. A estratégia de rotulagem sem rótulos ou mínimas é necessária para preservar a estrutura hidrofóbica das moléculas lipídicas⁵. Desenvolvimentos recentes em tecnologias de imagem criaram oportunidades emocionantes para imagens sem rótulos de lipídios em células vivas, tecidos e organismos.

Abordagens tradicionais para análises de armazenamento lipídico em amostras biológicas incluem ensaios bioquímicos e protocolos de coloração com corantes lipofílicos. Ensaios de quantificação bioquímica envolvendo espectrometria de massa (MS) são incomparáveis em sua resolução molecular, mas requerem quantidades de amostra muito grandes e a preparação da amostra geralmente leva várias horas, limitando sua aplicação para imagens em tempo real de sistemas vivos⁵. Outra grande limitação desses ensaios é a falta de informação espacial. Por outro lado, corantes lipofílicos como Oil Red O e Sudan Black fornecem tecido e distribuição celular de organelas de armazenamento lipídico e comparados às técnicas de ESM, esses métodos de coloração também são de baixo custo e fáceis de executar. No entanto, esses protocolos de coloração requerem fixação, que pode impactar a natureza hidrofóbica das gotículas lipídicas, gerar mudanças artificiais em sua estrutura e resultar em inconsistências entre os experimentos⁶. As dificuldades técnicas associadas às técnicas bioquímicas e de coloração levaram à busca de métodos livres de rótulos para imagens de moléculas lipídicas e ao rápido aumento do uso de microscopia coerente de dispersão de Raman (CRS) em imagens lipídicas.

O efeito Raman foi reconhecido pela primeira vez por Raman e Krishnan, onde eles relataram que ao interagir com um fóton, uma molécula pode gerar luz dispersa sem alteração no comprimento de onda (chamado dispersão de Rayleigh) ou raramente com um comprimento de onda alterado (chamado de dispersão de Raman) e essa mudança no comprimento de onda é característica dos grupos químicos funcionais dentro da molécula⁷. Quando as ligações químicas dentro de uma molécula ficam excitadas a um nível de energia vibracional mais alto por um fóton incidente, chamado fóton bomba, a energia do fóton disperso, chamado de fóton Stokes, fica mais baixa. Caso contrário, as ligações químicas podem atingir um nível de energia vibracional mais baixo se estiverem originalmente em um nível mais alto, e o fóton disperso ganhar energia para ser o fóton anti-Stokes. A diferença de frequência entre o incidente e os fótons dispersos é conhecida como a mudança de Raman. Cada ligação química dentro de uma molécula tem uma mudança raman característica e quantificável. Por exemplo, o vínculo CH₂ tem uma mudança raman de 2.845 cm^-1, que é abundante nas cadeias de ácidos graxos⁸. Este sinal espontâneo de Raman é geralmente muito fraco, o que limitou muito a velocidade de imagem na microscopia espontâneo convencional de Raman. Ao longo dos anos, várias abordagens foram desenvolvidas para aumentar a velocidade de imagem e a sensibilidade da microscopia espontânea de Raman. A microscopia de dispersão de Raman coerente, incluindo microscopia coerente de dispersão de Raman (CARS) e microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS), é o progresso mais recente. Carros e SRS têm princípios de trabalho ligeiramente diferentes, mas ambos são técnicas livres de rótulos que têm capacidade de imagem ao vivo, podem produzir informações espaciais e temporais sobre a dinâmica de armazenamento lipídial, e requerem apenas um pequeno tamanho amostral. A microscopia cars sofre de fundo não ressonante, que vem de vários processos não lineares, e os sinais CARS também têm relação não linear com a concentração da molécula, que juntas complicam o processo de quantificação⁹. Ao contrário da microscopia CARS, a microscopia SRS não gera sinais de fundo não ressonantes e oferece dependência linear da concentração da molécula de interesse. Assim, atualmente a microscopia SRS é mais amplamente utilizada para imagens lipídicas.

Na microscopia SRS, os sinais fracos espontâneos de Raman podem ser amplificados quando excitados por dois raios laser sincronizados com sua diferença de frequência que corresponde à frequência vibracional da ligação química. A molécula experimentará uma transição aprimorada para um estado animado devido à excitação coerente. Como resultado, a taxa de geração de fótons Stokes é aumentada. Consequentemente, a intensidade do feixe “Stokes” transmitido aumenta (estimulado o ganho de Raman, SRG) e a intensidade do feixe de “bomba” transmitido diminui (estimulado perda de Raman, SRL). A detecção de sinais SRG ou SRL está fundamentada para a imagem de microscopia de Dispersão de Raman (SRS) estimulada de moléculas com ligações químicas específicas¹⁰. Se a diferença de frequência entre os dois raios laser não corresponder à frequência vibracional da ligação química dentro de uma molécula de interesse, nem sinais SRG nem SRL serão gerados. A velocidade de imagem da microscopia SRS é de cerca de 2 μseg por pixel ou 1 segundo por quadro, o que é muito mais rápido do que a microscopia raman^{espontânea 11}. A resolução lateral típica para microscopia SRS é limitada e em torno de 300 nm. Além disso, os processos ópticos de dois fótons da microscopia SRS permitem imagens volumostricas 3D de amostras de tecido de espessura relativa e a profundidade de imagem pode chegar a 300-500 μm. No geral, a microscopia SRS apresenta uma técnica de imagem eficiente e livre de rótulos para detectar biomoléculas específicas, especialmente lipídios.

Gotículas lipídicas são organelas de membrana única, que são o principal local de armazenamento celular para lipídios neutros, incluindo os triacylglycerols (TAGs) e ésteres de colesterol (CEs). As ligações CH₂ nas cadeias de ácidos graxos dessas moléculas lipídicas geram fortes sinais de SRS a 2.845 cm^-1 quando excitadas⁸, permitindo assim a detecção e quantificação dos níveis lipídicos de armazenamento em células intactas, seções teciduais e até organismos inteiros^12,13,14,15. Em particular, c. elegans são úteis para estudos de imagem lipídica devido à sua transparência. Como os mamíferos, os C. elegans também armazenam lipídios em gotículas lipídicas e as vias de síntese e degradação das moléculas lipídicas são altamente conservadas¹⁶. Neste protocolo, forneceremos o princípio de trabalho da microscopia SRS, sua configuração fundamental e descreveremos os métodos para seu uso em imagens lipídicas em C. elegans.

Protocol

1. Configuração instrumental para Microscopia de Dispersão Raman Estimulada NOTA: O sistema de microscopia SRS é construído sobre um laser picosegundo com oscilador óptico integrado de bomba e um microscópio de varredura a laser confocal. O oscilador fornece dois trens de pulso picosegundo, incluindo um feixe de Stokes a 1.064 nm e um feixe de bomba incapaz entre 700-990 nm. A sobreposição temporal e espacial dos dois feixes são alcançadas dentro do laser. Um modulador eletro-óptico …

Representative Results

A sinalização de insulina é um importante caminho endócrino que impacta o desenvolvimento, a reprodução, a vida útil e o metabolismo. Em vermes, a sinalização de insulina consiste em cerca de 40 ligantes de peptídeo semelhantes à insulina, ortopal receptor de fator de crescimento semelhante à insulina DAF-2, cascata de quinase PI3K/AKT a jusante, e ortopal do fator de transcrição FoxO, DAF-1620. mutantes daf-2, que não possuem o receptor de insulina, têm mais gotículas li…

Discussion

Em defesa contra a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados, importantes esforços de pesquisa têm sido implementados para entender melhor os mecanismos regulatórios da homeostase lipídica. Para a detecção quantitativa de moléculas lipídicas em amostras biológicas, a imagem livre de rótulos por microscopia srs tem sido comprovadamente uma alternativa confiável para ensaios bioquímicos e outros métodos de coloração. Nosso grupo e outros revelaram novos mecanismos biológicos na regulação metab?…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP