Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Summary

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Abstract

El metabolismo lipídico es un proceso fisiológico fundamental necesario para la salud celular y del organismo. La desregulación del metabolismo lipídico a menudo provoca obesidad y muchas enfermedades asociadas, incluidos los trastornos cardiovasculares, la diabetes tipo II y el cáncer. Para avanzar en la comprensión actual de la regulación metabólica lipídica, los métodos cuantitativos para medir con precisión los niveles de almacenamiento de lípidos in vivo en el tiempo y el espacio se han vuelto cada vez más importantes y útiles. Los enfoques tradicionales para analizar el almacenamiento de lípidos son semicuantita cuantitativos para la evaluación microscópica o carecen de información espacio-temporal para la medición bioquímica. La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas que permite la detección rápida y cuantitativa de lípidos en células vivas con una resolución subcelular. Como el contraste se explota a partir de vibraciones moleculares intrínsecas, la microscopía SRS también permite el seguimiento cuatridimensional de lípidos en animales vivos. En la última década, la microscopía SRS ha sido ampliamente utilizada para imágenes de moléculas pequeñas en la investigación biomédica y superar las principales limitaciones de los métodos convencionales de tinción fluorescente y extracción de lípidos. En el laboratorio, hemos combinado la microscopía SRS con las herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para el poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar la distribución y heterogeneidad de las gotitas de lípidos a través de diferentes células y tejidos y, en última instancia, para descubrir nuevas vías de señalización conservadas que modulan el metabolismo lipídico. Aquí, presentamos los principios de trabajo y la configuración detallada del microscopio SRS y proporcionar métodos para su uso en la cuantificación del almacenamiento de lípidos en distintos puntos de tiempo de desarrollo de tipo salvaje y la señalización de insulina deficiente mutante C. elegans.

Introduction

La obesidad se ha convertido en un problema de salud global que amenaza a un tercio de la población en todo el mundo, y presenta una grave preocupación médica, dada su asociación con la mala salud mental¹ y enfermedades mortales como la diabetes^2,las enfermedades cardiovasculares³ y algunos tipos de cáncer^4. El estudio del metabolismo lipídico es esencial para comprender mejor los problemas biológicos detrás de la obesidad. La cuantificación rápida y específica del almacenamiento lipídico conlleva la detección de ácidos grasos y sus derivados, así como de metabolitos que contienen esteroles, con alta sensibilidad y preferiblemente con información espacial. Los lípidos son objetivos desafiantes para la imagen porque carecen de fluorescencia intrínseca y no se pueden etiquetar fácilmente fluorescentemente. Las etiquetas fluorescentes son a menudo más grandes que las moléculas lipídicas y, por lo tanto, pueden ser químicamente invasivas y poco prácticas para aplicaciones in vivo. La estrategia de etiquetado sin etiquetas o mínima es necesaria para preservar la estructura hidrofóbica de las moléculas lipídicas⁵. Los desarrollos recientes en tecnologías de la proyección de imagen han creado las oportunidades emocionantes para la proyección de imagen etiqueta-libre de lípidos en células, tejidos, y organismos vivos.

Los enfoques tradicionales para los análisis de almacenamiento de lípidos en muestras biológicas incluyen ensayos bioquímicos y protocolos de tinción con tintes lipofílicos. Los ensayos de cuantificación bioquímica que involucran espectrometría de masas (EM) son incomparables en su resolubilidad molecular, pero requieren cantidades de muestra muy grandes y la preparación de la muestra generalmente toma varias horas, lo que limita su aplicación para imágenes en tiempo real de sistemas vivos^5. Otra limitación importante de estos ensayos es la falta de información espacial. Por otro lado, los tintes lipofílicos como Oil Red O y Sudan Black proporcionan distribución tisular y celular de orgánulos de almacenamiento de lípidos y, en comparación con las técnicas de EM, estos métodos de tinción también son de bajo costo y fáciles de realizar. Sin embargo, estos protocolos de tinción requieren fijación, lo que puede impactar la naturaleza hidrofóbica de las gotitas lipídicas, generar cambios artificiales en su estructura y resultar en inconsistencias entre experimentos^6. Las dificultades técnicas asociadas a técnicas bioquímicas y de coloración han llevado a la búsqueda para los métodos etiqueta-libres para las moléculas del lípido de la imagen y al aumento rápido en el uso de la microscopia coherente de la dispersión de Raman (CRS) en proyección de imagen del lípido.

El efecto Raman fue reconocido por primera vez por Raman y Krishnan, donde informaron que al interactuar con un fotón, una molécula puede generar luz dispersa sin cambio en la longitud de onda (llamada dispersión de Rayleigh) o rara vez con una longitud de onda alterada (llamada dispersión Raman) y este cambio en la longitud de onda es característico de los grupos químicos funcionales dentro de la molécula⁷. Cuando los enlaces químicos dentro de una molécula se excitan a un nivel de energía vibracional más alto por un fotón incidente, llamado fotón de bomba, la energía del fotón disperso, llamado fotón de Stokes, se vuelve más baja. De lo contrario, los enlaces químicos pueden alcanzar un nivel de energía vibracional más bajo si originalmente están en un nivel más alto, y el fotón disperso gana energía para ser el fotón anti-Stokes. La diferencia de frecuencia entre los fotones incidentes y dispersos se conoce como el cambio Raman. Cada enlace químico dentro de una molécula tiene un cambio Raman característico y cuantificable. Por ejemplo, el enlace_CH2 tiene un desplazamiento Raman de 2.845 cm^-1,que es abundante en cadenas de ácidos grasos^8. Esta señal raman espontánea es generalmente muy débil, lo que ha limitado enormemente la velocidad de la proyección de imagen en microscopia raman espontánea convencional. A lo largo de los años, se han desarrollado varios enfoques para aumentar la velocidad de imagen y la sensibilidad de la microscopía Raman espontánea. La microscopía de dispersión Raman coherente, incluida la microscopía de dispersión Raman coherente anti-Stokes (CARS) y la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS), es el progreso más reciente. CARS y SRS tienen principios de trabajo ligeramente diferentes, pero ambas son técnicas sin etiquetas que tienen capacidad de imágenes en vivo, pueden producir información espacial y temporal sobre la dinámica de almacenamiento de lípidos y solo requieren un tamaño de muestra pequeño. La microscopía CARS sufre de fondo no resonante, que proviene de varios procesos no lineales, y las señales CARS también tienen relación no lineal con la concentración de la molécula, lo que en conjunto complica el proceso de cuantificación⁹. A diferencia de la microscopía CARS, la microscopía SRS no genera señales de fondo no resonantes y ofrece una dependencia lineal de la concentración de la molécula de interés. Por lo tanto, actualmente la microscopía SRS es más ampliamente utilizada para la obtención de imágenes lipídicas.

En microscopía SRS, las señales Raman espontáneas débiles se pueden amplificar cuando están excitadas por dos rayos láser sincronizados con su diferencia de frecuencia que coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico. La molécula experimentará una transición mejorada a un estado excitado debido a la excitación coherente. Como resultado, se aumenta la tasa de generación de fotones de Stokes. En consecuencia, la intensidad del haz “Stokes” transmitido aumenta (ganancia Raman estimulada, SRG) y la intensidad del haz de “bomba” transmitida disminuye (pérdida Raman estimulada, SRL). La detección de señales SRG o SRL subyace a la base para la obtención de imágenes de microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) de moléculas con enlaces químicos específicos¹⁰. Si la diferencia de frecuencia entre los dos rayos láser no coincide con la frecuencia vibracional del enlace químico dentro de una molécula de interés, no se generarán señales SRG ni SRL. La velocidad de imagen de la microscopía SRS es de alrededor de 2 μsec por píxel o 1 segundo por fotograma, que es mucho más rápido que la microscopía Raman espontánea¹¹. La resolución lateral típica para la microscopía SRS es difracción limitada y alrededor de 300 nm. Además, los procesos ópticos de dos fotones de la microscopía SRS permiten obtener imágenes volumétricas en 3D de muestras de tejido relativamente gruesas y la profundidad de la imagen podría alcanzar los 300-500 μm. En general, la microscopía SRS presenta una técnica de imagen eficiente y sin etiquetas para detectar biomoléculas específicas, especialmente lípidos.

Las gotitas de lípidos son orgánulos de una sola membrana, que son el principal sitio de almacenamiento celular para lípidos neutros, incluidos los triacilglicerols (TAGs) y los ésteres de colesterol (CE). Los_{enlaces CH2} en las cadenas de ácidos grasos de estas moléculas lipídicas generan fuertes señales de SRS a 2.845 cm^-1 cuando se^{excitan 8,}permitiendo así la detección y cuantificación de los niveles de lípidos de almacenamiento en células intactas, secciones de tejidos e incluso organismos enteros^12,13,14,15. Particularmente, los elegans de la C. son útiles para los estudios de la proyección de imagen del lípido debido a su transparencia. Al igual que los mamíferos, C. elegans también almacena lípidos en gotitas lipídicas y las vías de síntesis y degradación de las moléculas lipídicas están altamente conservadas¹⁶. En este protocolo, proporcionaremos el principio de funcionamiento de la microscopia SRS, su configuración fundamental y describiremos los métodos para su uso en imágenes lipídicas en C. elegans.

Protocol

1. Configuración instrumental para la microscopía de dispersión Raman estimulada NOTA: El sistema de microscopía SRS se basa en un láser de picosegundos con oscilador paramétrico óptico integrado en la bomba y un microscopio de barrido láser confocal. El oscilador proporciona dos trenes de impulsos de picosegundos, incluyendo un haz de Stokes a 1.064 nm y un haz de bomba sintonizable entre 700-990 nm. La superposición temporal y espacial de los dos haces se logra dentro del láser. Un m…

Representative Results

La señalización de la insulina es un camino endocrino importante que afecta el desarrollo, la reproducción, la vida útil, y el metabolismo. En los gusanos, la señalización de insulina consiste en aproximadamente 40 ligandos peptídicos similares a la insulina, ortólogos daf-2 del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, cascada de quinasa PI3K/AKT aguas abajo y el ortólogo del factor de transcripción FoxO, DAF-1620. los mutantes daf-2, que carecen del receptor de…

Discussion

En defensa contra la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados, se han implementado importantes esfuerzos de investigación para comprender mejor los mecanismos reguladores de la homeostasis lipídica. Para la detección cuantitativa de moléculas del lípido en muestras biológicas, la proyección de imagen etiqueta-libre por microscopia del SRS se ha demostrado para ser una alternativa confiable a los análisis bioquímicos y a otros métodos de coloración. Nuestro grupo y otros han revelado nuevos mecanismos b…

Materials

A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool – adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool – target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool – tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP