Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Summary

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Abstract

L’hématopoïèse clonale est une affection associée à l’âge répandue qui résulte de l’accumulation de mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Les mutations dans les gènes conducteurs, qui confèrent la forme physique cellulaire, peuvent conduire au développement de clones de HSPC en expansion qui donnent de plus en plus lieu à des leucocytes de descendance hébergeant la mutation somatique. Puisque l’hématopoïèse clonale a été associée aux maladies cardiaques, aux accidents vasculaires cérébraux, et à la mortalité, le développement des systèmes expérimentaux qui modélisent ces processus est essentiel pour comprendre les mécanismes qui sous-ensivent ce nouveau facteur de risque. Des procédures de transplantation de moelle impliquant le conditionnement myéloablatif chez la souris, telles que l’irradiation de corps entier (TBI), sont couramment employées pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans les maladies cardio-vasculaires. Cependant, des dommages simultanés à la niche de moelle osseuse et à d’autres sites d’intérêt, tels que le cœur et le cerveau, sont inévitables avec ces procédures. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles causés par TBI : 1) la transplantation de moelle avec blindage d’irradiation et 2) BMT adoptive aux souris non conditionnées. Dans les organes blindés, l’environnement local est préservé permettant l’analyse de l’hématopoïèse clonale tandis que la fonction des cellules immunitaires résidentes est intacte. En revanche, le BMT adoptif aux souris non conditionnées a l’avantage supplémentaire que les environnements locaux des organes et la niche hématopoïétique sont préservés. Ici, nous comparons trois différentes approches de reconstitution de cellules hématopoïétiques et discutons de leurs forces et limites pour des études de l’hématopoïèse clonale dans les maladies cardio-vasculaires.

Introduction

L’hématopoïèse clonale (CH) est une condition qui est fréquemment observée chez les personnes âgées et se produit à la suite d’un clone de tige et de cellule progéniteur hématopoïétique élargie (HSPC) portant une mutation génétique^1. On lui a suggéré qu’à l’âge de 50, la plupart des individus auront acquis une moyenne de cinq mutations exoniques dans chaque HSPC², mais la plupart de ces mutations auront comme conséquence peu ou pas de conséquences phénotypiques à l’individu. Cependant, si par hasard l’une de ces mutations confère un avantage concurrentiel au HSPC, par exemple en favorisant sa prolifération, son auto-renouvellement, sa survie ou une combinaison de ceux-ci, cela peut conduire à l’expansion préférentielle du clone mutant par rapport aux autres HSPCs. En conséquence, la mutation se propagera de plus en plus à travers le système hématopoïétique car le HSPC muté donne naissance à des cellules sanguines matures, conduisant à une population distincte de cellules mutées dans le sang périphérique. Alors que des mutations dans des dizaines de gènes pilotes candidats différents ont été associées à des événements clonaux dans le système hématopoïétique, parmi ceux-ci, les mutations dans l’ADN méthyltransférase 3 alpha (DNMT3A) et dix onze translocation 2 (TET2) sont les plus répandues³. Plusieurs études épidémiologiques ont révélé que les personnes porteuses de ces mutations génétiques présentent un risque significativement plus élevé de maladies cardiovasculaires (MCV), d’accidents vasculaires cérébraux et de mortalité entièrement causale^3,4,5,6,7. Tandis que ces études ont identifié qu’une association existe entre le CH et la plus grande incidence de CVD et de course, nous ne savons pas si ce rapport est causal ou un épiphenomenon partagé avec le processus vieillissant. Pour obtenir une meilleure compréhension de cette association, des modèles animaux appropriés qui récapitulent correctement la condition humaine du CH sont exigés.

Plusieurs modèles animaux ch ont été établis par notre groupe et d’autres utilisant des poissons zèbres, des souris et des primates non humains^{8,9,10,11,12,13,14.} Ces modèles utilisent souvent des méthodes de reconstitution hématopoïétique par transplantation de cellules génétiquement modifiées, parfois en utilisant la recombinaison Cre-lox ou le système CRISPR. Cette approche permet l’analyse d’une mutation génétique spécifique dans les cellules hématopoïétiques afin d’évaluer comment elle contribue au développement de la maladie. En outre, ces modèles utilisent souvent des cellules congéniques ou rapporteures pour distinguer les effets des cellules mutantes des cellules normales ou de type sauvage. Dans de nombreux cas, un régime de préconditionnement est nécessaire pour greffer avec succès les cellules souches hématopoïétiques de donneur.

Actuellement, la transplantation de moelle osseuse à des souris réceptrices peut être divisée en deux catégories principales : 1) conditionnement myéloablatif et 2) transplantation non conditionnée. Le conditionnement myéloablatif peut être réalisé par l’une des deux méthodes, à savoir l’irradiation corporelle totale (TBI) ou la chimiothérapie¹⁵. Le TBI est réalisé en soumettant le receveur à une dose létale d’irradiation gamma ou radiographique, générant des ruptures d’ADN ou des réticélisations au sein de cellules se divisant rapidement, les rendant irréparables^16. Le busulfan et le cyclophosphamide sont deux agents chimiothérapeutiques couramment utilisés qui perturbent la niche hématopoïétique et causent de la même manière des dommages à l’ADN aux cellules qui se divisent rapidement. Le résultat net du préconditionnement myéloablatif est l’apoptose des cellules hématopoïétiques, qui détruit le système hématopoïétique du receveur. Cette stratégie permet non seulement l’engraftment réussi du distributeur HSPCs, mais peut également empêcher le rejet de greffe en supprimant le recipient’ système immunitaire de s. Cependant, le préconditionnement myéloablatif a de graves effets secondaires tels que des dommages aux tissus et aux organes et à leurs cellules immunitaires résidentes ainsi que la destruction de la niche native de la moelle osseuse¹⁷. Par conséquent, des méthodes alternatives ont été proposées pour surmonter ces effets secondaires indésirables, en particulier en ce qui concerne les dommages aux organes d’intérêt. Ces méthodes comprennent l’irradiation blindée des souris réceptrices et l’MT adoptive sur des souris non conditionnées^9,17. Le fait de protéger le thorax, la cavité abdominale, la tête ou d’autres régions de l’irradiation par l’emplacement d’une barrière de plomb protège les tissus d’intérêt des effets nocifs de l’irradiation et maintient leur population résidente de cellules immunitaires. D’autre part, le BMT adoptif des HSPCs aux souris non conditionnées a un avantage supplémentaire car il préserve la niche hématopoïétique indigène. Dans ce manuscrit, nous décrivons les protocoles et les résultats de l’engraftment de HSPC après plusieurs régimes de transplantation chez les souris, spécifiquement la livraison de HSPC aux souris de TBI, aux souris partiellement protégées de l’irradiation, et aux souris non conditionnées. L’objectif global est d’aider les chercheurs à comprendre les différents effets physiologiques de chaque méthode ainsi que la façon dont ils affectent les résultats expérimentaux dans le contexte du CH et des maladies cardiovasculaires.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie. 1. Avant le préconditionnement Placer les souris réceptrices sur de l’eau supplémentée aux antibiotiques (5 mM de sulfaméthoxazole, 0,86 mM de triméthoprime) ~ 24 h avant l’irradiation. Ceci est nécessaire pour prévenir l’infection, car le système immunitaire sera supprimé après l’irradiation et maint…

Representative Results

Pour comparer l’effet de trois méthodes de BMT/pre-conditioning sur l’engraftment de distributeur de cellules, les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par cytometry d’écoulement à 1 mois de poteau-BMT. Des cellules d’isolement ont été souillées pour que les marqueurs spécifiques de leucocyte identifient les différents sous-ensembles de leucocytes. Dans ces expériences, le sauvage-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) cellules de moelle…

Discussion

Pour des études d’hématopoïèse clonale, nous avons décrit trois méthodes de BMT : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation avec le blindage partiel, et une méthode moins couramment utilisée de BMT qui n’implique aucun préconditionnement (BMT adoptif). Ces méthodes ont été utilisées pour évaluer l’impact de l’hématopoïèse clonale sur les maladies cardiovasculaires. Les chercheurs peuvent modifier ces méthodes en conséquence en fonction de l’objectif spécifique de leur …

Materials

0.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-121	general supply
1.5ml microcentrifuge	Fisher Scientific	05-408-129	general supply
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE	EXELINT	26028	general supply
Absolute Ethanol (200 prfof)	Fisher chemical	200559	general supply
BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle	Becton Dickinson	309626	general supply
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)	Becton Dickinson	395195	general supply
Cesium-137 Irradiator	J. L. Shepherd	Mark IV	equipment
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	general supply
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Life Sciences	353003	general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	352098	general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm	Fisher Scientific	22363548	general supply
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10	general supply
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-09	general supply
Isothesia (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Ketamine	Zoetis	043-304	injection
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	KCC34155	general supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk – Rodent Irradiator Disk	Braintree Scientific	IRD-P M	general supply
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim	TEVA	0703-9526-01	injection
Xylazine	Akorn	139-236	injection
X-ray irradiator	Rad source	RS-2000	equipment