JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/61883
, , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology,University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology,Princeton University, 4Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Een protocol om kankercellen en fibroblasten samen te injecteren en de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, wordt verstrekt. Dit protocol kan worden gebruikt om de moleculaire basis voor de rol van fibroblasten als regulatoren van tumorgroei te begrijpen.

Abstract

Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) kunnen een belangrijke rol spelen in tumorgroei door het creëren van een tumorbevorderende micro-omgeving. Modellen om de rol van CAFs in de tumormicro-omgeving te bestuderen, kunnen nuttig zijn voor het begrijpen van het functionele belang van fibroblasten, fibroblasten uit verschillende weefsels en specifieke genetische factoren in fibroblasten. Muismodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de bijdragen aan tumorgroei en -progressie in een in vivo context. Hier wordt een protocol gegeven waarin kankercellen worden gemengd met fibroblasten en in muizen worden geïntroduceerd om tumoren te ontwikkelen. Tumorgroottes in de loop van de tijd en uiteindelijke tumorgewichten worden bepaald en vergeleken tussen groepen. Het beschreven protocol kan meer inzicht geven in de functionele rol van CAFs in tumorgroei en -progressie.

Introduction

Binnen de micro-omgeving van de tumor is een van de meest prominente celtypen de kanker-geassocieerde fibroblast (CAF)1. Deze carcinoom-geassocieerde fibroblasten kunnen een tumoronderdrukkende rol spelen 2,3. S100A-tot expressie brengende fibroblasten scheiden bijvoorbeeld collageen af die kankerverwekkende stoffen kunnen inkapselen en beschermen tegen carcinoomvorming4. Verder veroorzaakt uitputting van α-gladde spieractine (SMA)-positieve myofibroblasten bij alvleesklierkanker immunosuppressie en versnelt de progressie van alvleesklierkanker2. CAFs kunnen ook co-evolueren met kankercellen en tumorprogressie bevorderen 5,6,7,8. Fibroblasten kunnen extracellulaire matrixeiwitten synthetiseren en afscheiden die een tumorbevorderende omgeving creëren8. Deze extracellulaire matrixeiwitten kunnen mechanische verstijving van het weefsel veroorzaken, wat geassocieerd is met tumorprogressie 9,10. De afgezette extracellulaire matrix kan fungeren als een fysieke barrière die immuuninfiltratie remt11. Matrixafzetting door CAFs is ook in verband gebracht met tumorinvasie, omdat is aangetoond dat fibronectine gegenereerd door CAFs tumorinvasie bevordert12. CAFs bevorderen angiogenese en rekruteren immunosuppressieve cellen naar de micro-omgeving van de tumor door het scheiden van transformerende groeifactor-β (TGF-β), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interleukine-6 (IL-6) en CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) 13,14,15. Vanwege hun centrale rol bij het bevorderen van tumorgroei, zijn kanker-geassocieerde fibroblasten een opkomend doelwit voor anti-kankertherapie 6,16,17,18.

Het onderstaande protocol beschrijft een methode om te testen hoe fibroblasten de groei van tumoren beïnvloeden in een goed ingeburgerd en veelgebruikt muismodel van tumorgroei. Om het belang van fibroblasten in de micro-omgeving van de tumor te begrijpen, werd het standaardprotocol voor het introduceren van kankercellen in muizen om hun groei te volgen aangepast om fibroblasten op te nemen met de introductie van kankercellen. De kankercellen kunnen subcutaan of intradermaal worden ingebracht. Intradermale introductie zou resulteren in tumoren die ontstaan uit de huid zelf. Xenografts waarin kankercellen en fibroblasten samen in muizen worden geïnjecteerd, vormen een belangrijk methodologisch hulpmiddel voor het ontleden van de rol van fibroblasten, subpopulaties van fibroblasten en eiwitfactoren in het vermogen om kankergroei te bevorderen 19,20,21. Een gedetailleerd protocol voor co-injectie van kankercellen en fibroblasten in muizen wordt verstrekt. Deze methode kan worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van fibroblasten te vergelijken, om fibroblasten uit verschillende bronnen te vergelijken20, of om fibroblasten te vergelijken met en zonder expressie van specifieke eiwitten19. Nadat de kankercellen en fibroblasten zijn geïntroduceerd, kan de tumorgrootte in de loop van de tijd worden gecontroleerd. Aan het einde van de experimenten kunnen tumoren worden ontleed en gewogen. Door de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, kan het belang van verschillende factoren worden ontleed.

Er zijn alternatieve benaderingen mogelijk voor het bestuderen van de rol van fibroblasten in tumorgroei. Als voorbeeld zijn er op Cre-loxed gebaseerde modellen die voorzien in weefselspecifieke knock-out van genen met drivers die bij voorkeur tot expressie komen in fibroblasten. Dergelijke benaderingen bieden ook mogelijkheden om de rol van specifieke genen en routes in fibroblasten voor tumorprogressie te onderzoeken. In vergelijking met op Cre-lox gebaseerde benaderingen, zou het verstrekte protocol een aanzienlijk snellere benadering vertegenwoordigen voor het monitoren van de rol van fibroblasten, omdat tumorgroei gedurende slechts enkele weken zou worden gevolgd. De geboden aanpak is ook aanzienlijk goedkoper omdat het niet nodig is om kolonies van genetisch gemanipuleerde muizen te genereren en te huisvesten. Het verstrekte protocol kan worden gebruikt om snel het effect van knockdown van verschillende genen te testen met behulp van shRNA’s in plaats van muizenkolonies te moeten ontwikkelen. De geboden aanpak is ook flexibeler omdat het een vergelijking mogelijk zou maken van verschillende aantallen fibroblasten, verschillende verhoudingen van kankercellen en fibroblasten, knockdown van verschillende genen en zelfs vergelijking van fibroblasten van verschillende weefsellocaties of soorten. Een Cre-lox benadering zou het voordeel hebben dat de fibroblasten in de muizen aanwezig zijn in een meer fysiologische context.

Het hier gerapporteerde protocol zou waardevol zijn voor wetenschappers die de effecten van fibroblasten op tumorgroei snel en kosteneffectief willen volgen. Dit protocol is vooral waardevol voor wetenschappers die verschillende subsets van fibroblasten of fibroblasten uit verschillende bronnen onderzoeken op tumorgroei op tumorgroei. Als het belangrijk is dat tumorinitiatie plaatsvindt in een fysiologische context, dan moeten genetisch gemanipuleerde muismodellen worden overwogen.

Er zijn verschillende mogelijke benaderingen voor het uitvoeren van deze experimenten. Immuun-competente muizen kunnen worden gebruikt als gastheren, wat onderzoek naar fibroblast-immuuncelinteracties mogelijk zou maken. Voor immuun-competente muismodellen moeten muizenkankercellen en muizenembryonale fibroblasten (MEF’s) worden geïnjecteerd. Het gebruik van MEF’s stelt de onderzoeker ook in staat om te profiteren van het brede scala aan knock-out muizenstammen om de aan- of afwezigheid van een interessant gen te testen. Als alternatief kunnen immuundeficiënte muizen worden gebruikt om de rol van menselijke fibroblasten te testen bij het bevorderen van de groei van tumoren bij muizen die zijn afgeleid van menselijke kankercellen. Introductie van de kankercellen kan subcutaan of orthotopisch worden uitgevoerd. Voor melanoom, zoals hieronder beschreven, kan het tumor-fibroblastmengsel intradermaal worden geïnjecteerd voor orthotopische injectie die de locatie in de huid waar een melanoom zich zou ontwikkelen nauwer simuleert.

Protocol

Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Californië, Los Angeles. OPMERKING: Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met de gastheermuizen voor muizenstam. Selecteer kankercellen en fibroblasten die overeenkomen met het geslacht van de gastheermuis. Verkrijg muizen uit broedkolonies of koop ze van gerenommeerde leveranciers. Introduceer tumoren in muizen die ~ 8-10 weken oud zijn. Muizen met vacht bevinden zich in d…

Representative Results

A2058 menselijke melanoomcellen en primaire menselijke dermale fibroblasten werden gekweekt onder steriele omstandigheden. Cellen werden verzameld en drie keer gewassen met PBS. Immunodeficiënte muizen (NU/J – Foxn1 naaktstam) werden subcutaan geïnjecteerd op één flank met alleen al 0,25 miljoen A2058 melanoomcellen. Op de andere flank werden muizen geïnjecteerd met een mengsel van 0,25 miljoen A2058-melanoomcellen en 0,75 miljoen fibroblasten. Cellen werden geïnjecteerd in 12 immuu…

Discussion

In het experiment in figuur 1 resulteerde het co-introduceren van menselijke dermale fibroblasten met menselijke A2058-melanoomcellen in grotere tumoren dan wanneer de melanoomcellen werden geïntroduceerd zonder co-geïnjecteerde fibroblasten. Dit verschil kan gemakkelijk worden gedetecteerd op basis van tumorvolume en tumorgewicht. De resultaten komen overeen met meerdere rapporten dat kanker-geassocieerde fibroblasten tumorgroei kunnen bevorderen 5,6,7,8.</sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen alle leden van het Coller-laboratorium bedanken voor hun nuttige input. H.A.C. was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation. We erkennen NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, het Iris Cantor Women’s Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, het Clinical Translational Science Institute en Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards van het Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills en Ha Gaba), een Award van de UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder awardnummer P50CA092131), een Innovation Award van het Broad Stem Cell Center, het Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research aan de UCLA, het Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), het Dermatology T32 Program aan UCLA AR071307 en het UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Materials

26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Recherche en cancérologie. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Recherche en cancérologie. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Recherche en cancérologie. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Recherche en cancérologie. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

Cancer-associated FibroblastsTumor GrowthMelanomaMouse ModelCell CultureTrypsin-EDTAHemocytometerCell Counting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image