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Recherche en cancérologie

Ein Mausmodell zur Untersuchung der Rolle krebsassoziierter Fibroblasten beim Tumorwachstum

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/61883
, , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology,University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology,Princeton University, 4Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Ein Protokoll zur Co-Injektion von Krebszellen und Fibroblasten und zur Überwachung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit wird bereitgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die molekularen Grundlagen für die Rolle von Fibroblasten als Regulatoren des Tumorwachstums zu verstehen.

Abstract

Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) können eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum spielen, indem sie eine tumorfördernde Mikroumgebung schaffen. Modelle zur Untersuchung der Rolle von CAFs in der Tumormikroumgebung können hilfreich sein, um die funktionelle Bedeutung von Fibroblasten, Fibroblasten aus verschiedenen Geweben und spezifischen genetischen Faktoren in Fibroblasten zu verstehen. Mausmodelle sind unerlässlich, um die Faktoren zu verstehen, die zum Tumorwachstum und zur Tumorprogression in einem In-vivo-Kontext beitragen. Hier wird ein Protokoll bereitgestellt, bei dem Krebszellen mit Fibroblasten gemischt und in Mäuse eingeführt werden, um Tumore zu entwickeln. Die Tumorgrößen im Zeitverlauf und die endgültigen Tumorgewichte werden bestimmt und zwischen den Gruppen verglichen. Das beschriebene Protokoll kann einen besseren Einblick in die funktionelle Rolle von CAFs beim Tumorwachstum und -fortschreiten geben.

Introduction

Innerhalb der Tumormikroumgebung ist einer der prominentesten Zelltypen der krebsassoziierte Fibroblast (CAF)1. Diese karzinomassoziierten Fibroblasten können eine tumorsuppressive Rolle spielen 2,3. Zum Beispiel sezernieren S100A-exprimierende Fibroblasten Kollagene, die Karzinogene einkapseln und vor Karzinombildung schützenkönnen 4. Darüber hinaus verursacht die Depletion von α-Smooth Muscle Actin (SMA)-positiven Myofibroblasten bei Bauchspeicheldrüsenkrebs eine Immunsuppression und beschleunigt das Fortschreiten von Bauchspeicheldrüsenkrebs2. CAFs können sich auch gemeinsam mit Krebszellen entwickeln und das Fortschreiten des Tumors fördern 5,6,7,8. Fibroblasten können extrazelluläre Matrixproteine synthetisieren und sezernieren, die eine tumorfördernde Umgebung schaffen8. Diese extrazellulären Matrixproteine können eine mechanische Versteifung des Gewebes verursachen, die mit einer Tumorprogressionverbunden ist 9,10. Die abgeschiedene extrazelluläre Matrix kann als physikalische Barriere wirken, die die Immuninfiltration hemmt11. Die Matrixablagerung durch CAFs wurde auch mit der Tumorinvasion in Verbindung gebracht, da gezeigt wurde, dass von CAFs erzeugtes Fibronektin die Tumorinvasion fördert12. CAFs fördern die Angiogenese und rekrutieren immunsuppressive Zellen in die Tumormikroumgebung, indem sie transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Interleukin-6 (IL-6) und CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) sezernieren13,14,15. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Förderung des Tumorwachstums sind krebsassoziierte Fibroblasten ein neues Ziel für die Krebstherapie 6,16,17,18.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zum Testen, wie Fibroblasten das Wachstum von Tumoren in einem etablierten und weit verbreiteten Mausmodell des Tumorwachstums beeinflussen. Um die Bedeutung von Fibroblasten in der Tumormikroumgebung zu verstehen, wurde das Standardprotokoll für die Einführung von Krebszellen in Mäuse zur Überwachung ihres Wachstums modifiziert, um Fibroblasten mit der Einführung von Krebszellen einzubeziehen. Die Krebszellen können subkutan oder intradermal eingeführt werden. Eine intradermale Einführung würde zu Tumoren führen, die von der Haut selbst ausgehen. Xenotransplantate, bei denen Krebszellen und Fibroblasten gemeinsam in Mäuse injiziert werden, stellen ein wichtiges methodisches Werkzeug dar, um die Rolle von Fibroblasten, Subpopulationen von Fibroblasten und Proteinfaktoren bei der Förderung des Krebswachstums zu analysieren 19,20,21. Ein detailliertes Protokoll für die Co-Injektion von Krebszellen und Fibroblasten in Mäuse wird bereitgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von Fibroblasten zu vergleichen, um Fibroblasten aus verschiedenen Quellen zu vergleichen20 oder um Fibroblasten mit und ohne Expression spezifischer Proteine19 zu vergleichen. Nachdem die Krebszellen und Fibroblasten eingeführt wurden, kann die Tumorgröße im Laufe der Zeit überwacht werden. Am Ende der Experimente können Tumore seziert und gewogen werden. Durch die Überwachung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit kann die Bedeutung verschiedener Faktoren analysiert werden.

Es gibt mögliche alternative Ansätze, um die Rolle von Fibroblasten beim Tumorwachstum zu untersuchen. Als Beispiel gibt es Cre-loxed-basierte Modelle, die einen gewebespezifischen Knockout von Genen mit Treibern ermöglichen, die bevorzugt in Fibroblasten exprimiert werden. Solche Ansätze bieten auch die Möglichkeit, die Rolle spezifischer Gene und Signalwege in Fibroblasten für die Tumorprogression zu untersuchen. Im Vergleich zu Cre-lox-basierten Ansätzen würde das bereitgestellte Protokoll einen deutlich schnelleren Ansatz zur Überwachung der Rolle von Fibroblasten darstellen, da das Tumorwachstum über nur wenige Wochen überwacht würde. Der bereitgestellte Ansatz ist auch deutlich kostengünstiger, da keine Kolonien gentechnisch veränderter Mäuse erzeugt und untergebracht werden müssen. Das bereitgestellte Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung des Knockdowns verschiedener Gene mithilfe von shRNAs schnell zu testen, anstatt Mauskolonien entwickeln zu müssen. Der bereitgestellte Ansatz ist auch flexibler, da er einen Vergleich einer unterschiedlichen Anzahl von Fibroblasten, unterschiedlichen Verhältnissen von Krebszellen und Fibroblasten, einen Knockdown verschiedener Gene und sogar einen Vergleich von Fibroblasten aus verschiedenen Gewebestellen oder Spezies ermöglichen würde. Ein Cre-lox-Ansatz hätte den Vorteil, dass die Fibroblasten in den Mäusen in einem physiologischeren Kontext vorhanden sind.

Das hier berichtete Protokoll wäre wertvoll für Wissenschaftler, die die Auswirkungen von Fibroblasten auf das Tumorwachstum schnell und kostengünstig überwachen wollen. Dieses Protokoll ist besonders wertvoll für Wissenschaftler, die verschiedene Untergruppen von Fibroblasten oder Fibroblasten aus verschiedenen Quellen auf das Tumorwachstum untersuchen. Wenn es wichtig ist, dass die Tumorinitiierung in einem physiologischen Kontext erfolgt, sollten gentechnisch veränderte Mausmodelle in Betracht gezogen werden.

Es gibt mehrere mögliche Ansätze für die Durchführung dieser Experimente. Immunkompetente Mäuse können als Wirte verwendet werden, was die Untersuchung von Fibroblasten-Immunzell-Interaktionen ermöglichen würde. Für immunkompetente Mausmodelle müssen Mauskrebszellen und embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus injiziert werden. Die Verwendung von MEFs ermöglicht es dem Forscher auch, die breite Palette von Knockout-Mausstämmen zu nutzen, um das Vorhandensein oder Fehlen eines interessierenden Gens zu testen. Alternativ können immundefiziente Mäuse verwendet werden, um die Rolle menschlicher Fibroblasten bei der Förderung des Wachstums von Tumoren bei Mäusen zu testen, die von menschlichen Krebszellen stammen. Die Einführung der Krebszellen kann subkutan oder orthotopisch erfolgen. Beim Melanom kann, wie unten beschrieben, das Tumor-Fibroblasten-Gemisch intradermal injiziert werden, um eine orthotope Injektion durchzuführen, die die Stelle in der Haut, an der sich ein Melanom entwickeln würde, genauer simuliert.

Protocol

Alle beschriebenen Experimente wurden vom Animal Care Committee der University of California, Los Angeles, genehmigt. HINWEIS: Wählen Sie Krebszellen und Fibroblasten aus, die den Wirtsmäusen für den Mausstamm entsprechen. Wählen Sie Krebszellen und Fibroblasten aus, die dem Geschlecht der Wirtsmaus entsprechen. Holen Sie sich Mäuse aus Zuchtkolonien oder kaufen Sie sie von seriösen Anbietern. Führen Sie Tumore in Mäuse ein, die ~ 8-10 Wochen alt sind. Mäuse mit Fell befinden sich in …

Representative Results

A2058 humane Melanomzellen und primäre humane dermale Fibroblasten wurden unter sterilen Bedingungen kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Immundefiziente Mäuse (NU/J – Foxn1 nude strain) wurden subkutan an einer Flanke mit 0,25 Millionen A2058 Melanomzellen allein injiziert. Auf der anderen Flanke wurde Mäusen eine Mischung aus 0,25 Millionen A2058-Melanomzellen und 0,75 Millionen Fibroblasten injiziert. Zellen wurden in 12 immundefiziente Mäuse injiz…

Discussion

In dem Experiment in Abbildung 1 führte die gleichzeitige Einführung menschlicher dermaler Fibroblasten mit menschlichen A2058-Melanomzellen zu größeren Tumoren als bei der Einführung der Melanomzellen ohne co-injizierte Fibroblasten. Dieser Unterschied konnte anhand des Tumorvolumens und des Tumorgewichts leicht festgestellt werden. Die Ergebnisse stimmen mit mehreren Berichten überein, dass krebsassoziierte Fibroblasten das Tumorwachstum fördern können<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern des Coller-Labors für ihren hilfreichen Input. H.A.C. war der Milton E. Cassel-Stipendiat der Rita Allen Foundation. Wir würdigen NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, das Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, das Koordinierungskomitee für Krebsforschung der Universität von Kalifornien, den Metabolismus Theme Award der David Geffen School of Medicine, das Clinical Translational Science Institute und das Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovationspreise des Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills und Ha Gaba), eine Auszeichnung des UCLA SPORE in Prostatakrebs (National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer P50CA092131), ein Innovationspreis des Broad Stem Cell Center, des Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, das Tumorzellbiologie-Trainingsprogramm (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), das Dermatologie-T32-Programm an der UCLA AR071307 und das UCLA-Trainingsprogramm für Muskelzellbiologie, Pathophysiologie und Therapeutika T32 5 T32 AF 65972.

Materials

26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228
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References

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Keywords: Cancer-associated FibroblastsTumor GrowthMelanomaMouse ModelCell CultureTrypsin-EDTAHemocytometerCell Counting
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Citer Cet Article
Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).
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