En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst

Summary

En protokoll for å injisere kreftceller og fibroblaster og overvåke tumorvekst over tid er gitt. Denne protokollen kan brukes til å forstå det molekylære grunnlaget for rollen som fibroblaster som regulatorer av tumorvekst.

Abstract

Kreftassosierte fibroblaster (CAF) kan spille en viktig rolle i tumorvekst ved å skape et tumorfremmende mikromiljø. Modeller for å studere rollen til CAF i tumormikromiljøet kan være nyttige for å forstå den funksjonelle betydningen av fibroblaster, fibroblaster fra forskjellige vev og spesifikke genetiske faktorer i fibroblaster. Musemodeller er avgjørende for å forstå bidragsyterne til tumorvekst og progresjon i en in vivo sammenheng. Her er det gitt en protokoll der kreftceller blandes med fibroblaster og introduseres i mus for å utvikle svulster. Tumorstørrelser over tid og endelige tumorvekter bestemmes og sammenlignes mellom grupper. Den beskrevne protokollen kan gi mer innsikt i den funksjonelle rollen til CAFs i tumorvekst og progresjon.

Introduction

Innenfor tumormikromiljøet er en av de mest fremtredende celletypene kreftassosiert fibroblast (CAF)¹. Disse karsinomassosierte fibroblastene kan spille en tumorundertrykkende rolle ^2,3. For eksempel utskiller S100A-uttrykkende fibroblaster kollagener som kan kapsle inn kreftfremkallende stoffer og beskytte mot karsinomdannelse⁴. Videre forårsaker uttømming av α-glatt muskelaktin (SMA)-positive myofibroblaster i kreft i bukspyttkjertelen immunosuppresjon og akselererer progresjon av kreft i bukspyttkjertelen². CAF kan også utvikle seg sammen med kreftceller og fremme tumorprogresjon 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisere og utskille ekstracellulære matriksproteiner som skaper et tumorfremmende miljø⁸. Disse ekstracellulære matriksproteinene kan forårsake mekanisk avstivning av vevet, som er forbundet med tumorprogresjon ^9,10. Den avsatte ekstracellulære matriksen kan fungere som en fysisk barriere som hemmer immuninfiltrasjon¹¹. Matriksavsetning av CAF har også vært assosiert med tumorinvasjon, da fibronektin generert av CAF har vist seg å fremme tumorinvasjon¹². CAF fremmer angiogenese og rekrutterer immunsuppressive celler til tumormikromiljøet ved å utskille transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) og CXC-kjemokinligand 12 (CXCL12) ^13,14,15. På grunn av deres sentrale rolle i å fremme tumorvekst, er kreftassosierte fibroblaster et fremvoksende mål for kreftbehandling 6,16,17,18.

Protokollen nedenfor beskriver en metode for å teste hvordan fibroblaster påvirker veksten av svulster i en veletablert og mye brukt musemodell av tumorvekst. For å forstå betydningen av fibroblaster i tumormikromiljøet ble standardprotokollen for innføring av kreftceller i mus for å overvåke veksten modifisert for å inkludere fibroblaster med kreftcelleinnføringen. Kreftcellene kan innføres subkutant eller intradermalt. Intradermal introduksjon vil resultere i svulster som oppstår fra selve huden. Xenotransplantater der kreftceller og fibroblaster injiseres samtidig i mus, representerer et viktig metodologisk verktøy for å dissekere rollen til fibroblaster, subpopulasjoner av fibroblaster og proteinfaktorer i evnen til å fremme kreftvekst 19,20,21. En detaljert protokoll for samtidig injeksjon av kreftceller og fibroblaster i mus er gitt. Denne metoden kan brukes til å sammenligne tilstedeværelsen eller fraværet av fibroblaster, for å sammenligne fibroblaster fra forskjellige kilder²⁰, eller for å sammenligne fibroblaster med og uten uttrykk for spesifikke proteiner¹⁹. Etter at kreftcellene og fibroblastene er introdusert, kan tumorstørrelsen overvåkes over tid. På slutten av forsøkene kan svulster dissekeres og veies. Ved å overvåke tumorvekst over tid, kan betydningen av ulike faktorer dissekeres.

Det finnes mulige alternative tilnærminger for å studere rollen som fibroblaster i tumorvekst. Som et eksempel er det Cre-loxed-baserte modeller som sørger for vevsspesifikk knockout av gener med drivere uttrykt fortrinnsvis i fibroblaster. Slike tilnærminger gir også muligheter til å undersøke rollen som spesifikke gener og veier i fibroblaster for tumorprogresjon. Sammenlignet med Cre-lox-baserte tilnærminger, vil protokollen som tilbys representere en betydelig raskere tilnærming til overvåking av rollen til fibroblaster fordi tumorvekst vil bli overvåket i løpet av bare noen få uker. Den medfølgende tilnærmingen er også betydelig billigere fordi den ikke krever generering og oppbevaring av kolonier av genetisk utviklede mus. Protokollen som tilbys kan brukes til raskt å teste effekten av knockdown av forskjellige gener ved hjelp av shRNA i stedet for å måtte utvikle musekolonier. Den medfølgende tilnærmingen er også mer fleksibel fordi den vil tillate en sammenligning av forskjellige antall fibroblaster, forskjellige forhold mellom kreftceller og fibroblaster, knockdown av forskjellige gener og til og med sammenligning av fibroblaster fra forskjellige vevssteder eller arter. En Cre-lox tilnærming ville ha fordelen at fibroblastene er tilstede i musene i en mer fysiologisk sammenheng.

Protokollen rapportert her vil være verdifull for forskere som søker å overvåke effekten av fibroblaster på tumorvekst raskt og kostnadseffektivt. Denne protokollen er spesielt verdifull for forskere som undersøker forskjellige undergrupper av fibroblaster eller fibroblaster fra forskjellige kilder på tumorvekst på tumorvekst. Hvis det er viktig at tumorinitiering skjer i en fysiologisk sammenheng, bør genetisk konstruerte musemodeller vurderes.

Det er flere mulige tilnærminger for å utføre disse eksperimentene. Immunkompetente mus kan brukes som verter, noe som vil tillate undersøkelse av fibroblast-immuncelleinteraksjoner. For immunkompetente musemodeller må musekreftceller og museembryonale fibroblaster (MEF) injiseres. Bruken av MEF-er gjør det også mulig for etterforskeren å dra nytte av det brede spekteret av knockout-musestammer for å teste tilstedeværelsen eller fraværet av et gen av interesse. Alternativt kan immundefekte mus brukes til å teste rollen som humane fibroblaster i å fremme veksten av svulster hos mus som er avledet fra humane kreftceller. Innføring av kreftcellene kan utføres subkutant eller ortopisk. For melanom, som beskrevet nedenfor, kan tumor-fibroblastblandingen injiseres intradermalt for ortotopisk injeksjon som nærmere simulerer stedet i huden der et melanom vil utvikle seg.

Protocol

Alle de beskrevne forsøkene ble godkjent av Animal Care Committee ved University of California, Los Angeles. MERK: Velg kreftceller og fibroblaster som samsvarer med vertsmusene for musestamme. Velg kreftceller og fibroblaster som samsvarer med vertsmusens kjønn. Få mus fra avlskolonier eller kjøp dem fra anerkjente leverandører. Introduser svulster i mus som er ~ 8-10 ukers alder. Mus med pels vil være i telogen eller hvilefasen av hårsekksyklusen. Planlegg for et forhold på 0,5 til 3…

Representative Results

A2058 humane melanomceller og primære humane dermale fibroblaster ble dyrket under sterile forhold. Cellene ble samlet inn og vasket tre ganger med PBS. Immundefekte mus (NU/J – Foxn1 nakenstamme) ble injisert subkutant på en flanke med 0,25 millioner A2058 melanomceller alene. På den andre flanken ble mus injisert med en blanding av 0,25 millioner A2058 melanomceller og 0,75 millioner fibroblaster. Celler ble injisert i 12 immundefekte mus. Injeksjoner i venstre og høyre flanke ble r…

Discussion

I forsøket i figur 1 resulterte samtidig introduksjon av humane dermale fibroblaster med humane A2058 melanomceller i større svulster enn når melanomcellene ble introdusert uten samtidig injiserte fibroblaster. Denne forskjellen kan lett oppdages basert på tumorvolum og tumorvekt. Resultatene stemmer overens med flere rapporter om at kreftassosierte fibroblaster kan fremme tumorvekst 5,6,7,8.<su…

Materials

26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228