Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le tissu adipeux viscéral (VAT) est un organe métabolique actif composé principalement d’adipocytes matures et de cellules de fraction vasculaire stromale (SVF), qui libèrent différentes molécules bioactives qui contrôlent les processus métaboliques, hormonaux et immunitaires ; Actuellement, on ne sait pas comment ces processus sont régulés dans le tissu adipeux. Par conséquent, le développement de méthodes évaluant la contribution de chaque population cellulaire à la physiopathologie du tissu adipeux est crucial. Ce protocole décrit les étapes d’isolement et fournit les directives de dépannage nécessaires pour isoler efficacement les adipocytes matures viables et la SVF des biopsies de TVA humaine en un seul processus, en utilisant une technique de digestion enzymatique de la collagénase. De plus, le protocole est également optimisé pour identifier les sous-ensembles de macrophages et effectuer l’isolement d’ARN adipocytaires matures pour les études d’expression génique, ce qui permet de réaliser des études disséquant l’interaction entre ces populations cellulaires. En bref, les biopsies de VAT sont lavées, hachées mécaniquement et digérées pour générer une suspension unicellulaire. Après centrifugation, les adipocytes matures sont isolés par flottation à partir de la pastille SVF. Le protocole d’extraction d’ARN garantit un rendement élevé d’ARN total (y compris les miARN) des adipocytes pour les tests d’expression en aval. Simultanément, les cellules SVF sont utilisées pour caractériser les sous-ensembles de macrophages (phénotype pro- et anti-inflammatoire) par analyse par cytométrie en flux.
Introduction
Le tissu adipeux blanc est composé non seulement de cellules adipeuses ou adipocytes, mais aussi d’une fraction de cellules non graisseuses connue sous le nom de fraction vasculaire stromale (SVF), qui contient une population cellulaire hétérogène composée de macrophages, d’autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et d’éosinophiles, de préadipocytes et de fibroblastes, entourés de tissu vasculaire et conjonctif 1,2. Le tissu adipeux (TA) est maintenant considéré comme un organe qui régule les processus physiologiques liés au métabolisme et à l’inflammation par le biais d’adipoki....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Ce protocole a été approuvé par l’IRB de l’Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La participation était volontaire et toutes les femmes inscrites ont signé le formulaire de consentement éclairé.
1. Prélèvement de tissu adipeux viscéral
- Obtenez des biopsies de TVA par omentectomie partielle pendant la césarienne de femmes adultes en bonne santé ayant une grossesse unique à terme sans travail.
- Après la fermeture utérine et l’hémostase, procédez à l’identification du plus grand épiploon et étendez-le sur une compresse humide. L’AT exposée est la TVA.
- Localisez le plus gros vaisseau sanguin....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Ce protocole décrit une méthode enzymatique utilisant la digestion de la collagénase suivie d’une centrifugation différentielle pour isoler, en un seul processus, des adipocytes matures viables et des cellules SVF à partir de biopsies de TVA obtenues sur des femmes enceintes en bonne santé après une omentectomie partielle. Dans ce cas, nous utilisons les adipocytes pour l’extraction de l’ARN et le SVF pour le phénotypage des macrophages.
Le protocole d’extraction de l’ARN a permis d’obtenir de.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La TVA joue un rôle crucial dans la régulation métabolique et l’inflammation. L’intérêt croissant pour le rôle des adipocytes et des cellules immunitaires dans l’inflammation chronique associée à l’obésité a conduit au développement de différentes techniques pour séparer les SVF et les cellules graisseuses présentes dans l’AT. Cependant, la plupart des techniques ne permettent pas d’obtenir ces deux ensembles différents de cellules viables pour des applications en aval à partir d’une même biopsie de TVA en une seule proc.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été financée par l’Instituto Nacional de Perinatologia (numéros de subvention : 3300-11402-01-575-17 et 212250-3210-21002-06-15) et le CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numéro de subvention 2015-3-2-61661).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes PCR 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase libre et apyrogène |
| Tubes microcentrifuges 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase et apyrogène |
| 10 mL Pipettes sérologiques | Corning | CLS4101-50EA | Emballées individuellement |
| 10 µ ; L pointe de pipette universelle | Axygen | T-300-L-R | RNase, sans DNase et apyrogène |
| 10 & micro ; L pointe de pipette universelle | Axygen | T-300-R-S | RNase, sans DNase et apyrogène |
| 1000 µ ; L pointe de pipette universelle | Axygen | T-1000-B-R | RNase, sans DNase et apyrogène |
| Tube de microcentrifugation de 2,0 mL | Axygen | MCT-200-C | RNase, sans DNase et apyrogène |
| 200 µ ; L pointe de pipette universelle | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase sans DNase et apyrogène |
| 2100 Bioanalyseur Agilent | |||
| G2939BA-2101 Bioanalyseur PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Logiciel préinstallé dans le PC |
| 5 ml Tube à essai en polystyrène à fond rond | Corning | 352003 ; | Capuchon à pression, stérile |
| Tubes à centrifuger de 50 mL | Corning | CLS430828-100EA | Réactif à base de polypropilène, à fond conique et stérile |
| base d’acide-guanidinium-phénol | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI ou similaire |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511-Agilent | |
| Small RNA Kit Agilent | 5067-1548-APC | ||
| /Cy7 Anticorps CD14 humain | BioLegend | 325620 | 0,4 mg/106 cellules, présentes sur les monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non stérile |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Fraction de choc thermique, pH 5,2, &ge ; 96 % |
| Station d’amorçage de puce | Agilent | 5065-9951-Collagénase | |
| type II | Gibco | 17101-015 | Poudre |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Poudre |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Livré avec 50 mL TRI reagen |
| Pince à dissectionner | - | - | Acier, mâchoires dentelées et rondes extrémités |
| Plateau de dissection | - | - | Acier inoxydable |
| Alcool éthylique | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 ; preuve, pour la biologie moléculaire |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003-FACS | |
| Lysing Solution BD | Biosciences | 349202-FACSAria | |
| III Cytomètre en flux/Trieur de cellules | BD Biosciences | ||
| 648282-FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 préinstallé |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA-Compteur | |
| de cellules manuel | - | - | |
| Ciseaux de dissection Mayo | - | - | Microcentrifugeuse en acier inoxydable |
| - | - | ||
| Spectrophotomètre Nanodrop | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP-Agitateur | |
| orbital | - | - | Température et vitesse réglables |
| P10 ; Volume variable ; micropipette ; | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 à 10 &mu ; L |
| P1000 ; Volume variable ; micropipette ; | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 à 1000 &mu ; L |
| P2 ; Volume variable ; micropipette ; | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0,2 à 2 &mu ; L |
| P200 ; Volume variable ; micropipette ; | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 à 200 &mu ; L |
| Rack de stockage de tubes PCR | Axygen | R96PCRFSP-PE | |
| /Cy5 anti-HLA-DR humain | BioLegend | 307608 | 0,0625 mg/106 cellules, présentes sur les macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-humain CD45 Anticorps | BioLegend | 304016 | 0,1 mg/106 cellules, présentes sur les leucocytes, clone H130 |
| Solution saline | tamponnée au phosphateSigma-Aldrich | P3813-10PAK | Poudre, pH 7,4, pour la préparation de solutions de 1 L |
| Contrôleur de pipette | - | -- | |
| Tampon de lyse des globules rouges | Roche | 11 814 389 001 | Pour la lyse préférentielle des globules rouges du sang total humain |
| Centrifugeuse réfrigérée | - | - | Adaptateur Whit pour tubes coniques de 50 mL |
| Récipient d’échantillons | - | - | - |
| Pipette de transfert | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Trypan stérile |
| Bleu | Gibco | 15250-061 | 0,4 % |
| Solution Porte-tubes | - | - | Pour différentes tailles de tubes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
Références
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Ibrahim, M. M.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
