Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica
Summary
Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.
Abstract
Le firebrat Thermobia domestica est une espèce amétabolique et sans ailes qui convient à l’étude des mécanismes de développement des insectes qui ont mené à leur rayonnement évolutif réussi sur la terre. L’application d’outils génétiques tels que l’édition du génome est la clé pour comprendre les changements génétiques qui sont responsables des transitions évolutionnaires dans une approche Evo-Devo. Dans cet article, nous décrivons notre protocole actuel pour générer et maintenir des souches mutantes de T. domestica. Nous rapportons une méthode d’injection sèche, comme alternative à la méthode d’injection humide rapportée, qui nous permet d’obtenir des taux de survie sensiblement élevés dans les embryons injectés. Nous signalons également un environnement optimisé pour accoupler les adultes et obtenir les générations suivantes avec une grande efficacité. Notre méthode souligne l’importance de tenir compte de la biologie unique de chaque espèce pour l’application réussie des méthodes d’édition du génome aux organismes modèles non traditionnels. Nous prévoyons que ces protocoles d’édition du génome aideront à mettre en œuvre T. domestica en tant que modèle de laboratoire et à accélérer davantage le développement et l’application d’outils génétiques utiles chez cette espèce.
Introduction
Thermobia domestica appartient à l’un des ordres d’insectes les plus basiques, Zygentoma, qui conserve un cycle de vie ancestral amétabolique et sans ailes. Cette position phylogénétique basale et ses caractéristiques ancestrales placent cette espèce comme un modèle attrayant pour l’étude des mécanismes sous-jacents au succès des insectes sur Terre, qui couvrent plus de 70 % des espèces animalesdécrites 1. T. domestica a longtemps été utilisé principalement pour étudier les caractéristiques ancestrales de la physiologie des insectes en raison de ses caractéristiques appropriées en tant que modèle de laboratoire, comme un cycle de vie relativement court (2,5-3,0 mois de l’embryon à l’adulte reproducteur; Figure 1A) et une reproduction facile. Au cours des trois dernières décennies, son utilisation a été élargie pour étudier les caractéristiques ancestrales de divers traits tels que le plan corporel, la différenciation neuronale et les rythmescircadiens 2,3,4.
L’application d’outils génétiques avancés dans T. domestica pourrait encore accélérer ces contributions dans un vaste domaine de recherche. L’interférence réussie d’ARN (RNAi)-2-2meint le renversement de gène dans les embryons, les nymphes, et les adultes a été rapporté dans T. domestica4,5,6. L’efficacité de l’ARNi systémique est encore fortement tributaire des espèces — par exemple, elle est généralement élevée chez les coléoptères alors qu’elle est faible dans l’ordre des lépidoptères7. L’efficacité et la durée du renversement du RNAi à T. domestica n’ont pas encore été évaluées. En plus de RNAi, nous avons précédemment rapporté un succès CRISPR/Cas9-19-20 knockout gène dans T. domestica8. Le système CRISPR/Cas a été largement appliqué pour l’édition du génome chez les insectes en particulier pour les knockout génétiques ciblés. Son utilisation pourrait être étendue pour d’autres applications telles que l’analyse de journaliste de gène, le suivi de lignée cellulaire, et la manipulation de l’activité transcriptionnelle en frappant-dans les constructions exogènes après l’établissement d’un protocole pour livrer des composants du système CRISPR/Cas dans les noyaux9. Combinée à l’assemblage dugénome publié 10, l’utilisation à grande échelle et le développement ultérieur de l’édition du génome crispr/cas dans T. domestica faciliteraient des études axées sur les mécanismes évolutifs derrière le succès adaptatif exceptionnel des insectes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la microinjection embryonnaire et pour l’accouplement adulte T. domestica pour générer une souche mutante à l’aide de CRISPR/Cas9. Compte tenu de cette nouvelle méthode, nous discutons de l’importance de considérer la biologie unique des espèces modèles non traditionnelles pour des applications réussies de ces techniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour la génération réussie du mutant T. domestica désiré avec CRISPR/Cas9, il est d’abord important de recueillir un nombre suffisant d’embryons mis en scène pour injection. Pour une collecte constante d’un nombre suffisant d’œufs T. domestica, la clé est de sélectionner une taille appropriée du récipient pour avoir une densité de population inférieure, car elle aiderait à l’achèvement réussi d’une série de comportements complexes d’accouplement, qui se répète après cha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
To et TD ont été soutenus par les numéros de subvention JSPS KAKENHI 19H02970 et 20H02999, respectivement.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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