Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Summary

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Abstract

Komplexe Krankheitsmodelle erfordern modernste Werkzeuge, die in der Lage sind, physiologisch und pathologisch relevante, umsetzbare Erkenntnisse zu liefern und ansonsten unsichtbare Prozesse aufzudecken. Fortschrittliche Zellassays, die die In-vivo-Landschaft genau nachahmen, etablieren sich als neuartige Methoden zur Visualisierung und Messung des bidirektionalen Tumor-Wirt-Zusammenspiels, das das Fortschreiten von Krebs beeinflusst. Hier beschreiben wir zwei vielseitige Protokolle zur Nachbildung hochgradig kontrollierbarer 2D- und 3D-Kokulturen in Mikrogeräten, die die Komplexität der Tumormikroumgebung (TME) nachahmen, unter natürlicher und therapieinduzierter Immunüberwachung. In Abschnitt 1 wird eine experimentelle Umgebung bereitgestellt, um das Übersprechen zwischen adhärenten Tumorzellen und schwebenden Immunpopulationen durch Hellfeld-Zeitraffermikroskopie zu überwachen. Als Anwendungsszenario analysieren wir die Auswirkungen von Krebstherapien, wie z.B. den sogenannten immunogenen Krebszelltod-Induktoren, auf die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen. In Abschnitt 2 werden 3D-Tumor-Immun-Mikroumgebungen in einem kompetitiven Layout zusammengestellt. Die differentielle Immuninfiltration wird durch Fluoreszenz-Snapshots bis zu 72 h überwacht, um therapeutische Kombinationsstrategien zu bewerten. In beiden Situationen werden Bildverarbeitungsschritte veranschaulicht, um eine Vielzahl von Immunzellparametern zu extrahieren (z. B. Immunzellmigration und -interaktion, Reaktion auf Therapeutika). Diese einfachen und leistungsfähigen Methoden können weiter zugeschnitten werden, um die Komplexität der TME zu simulieren, die die Heterogenität und Plastizität von Krebs-, Stroma- und Immunzell-Subtypen sowie ihre wechselseitigen Wechselwirkungen als Treiber der Krebsevolution umfasst. Die Übereinstimmung dieser sich schnell entwickelnden Technologien mit der High-Content-Bildgebung lebender Zellen kann zur Generierung großer informativer Datensätze führen, was neue Herausforderungen mit sich bringt. In der Tat weist das Dreieck “Co-Kulturen/Mikroskopie/fortgeschrittene Datenanalyse” den Weg zu einer präzisen Problemparametrisierung, die maßgeschneiderte therapeutische Protokolle unterstützen kann. Wir gehen davon aus, dass die zukünftige Integration von Krebsimmun-On-a-Chip mit künstlicher Intelligenz für die Hochdurchsatzverarbeitung einen großen Schritt nach vorne bei der Nutzung der Fähigkeiten als prädiktive und präklinische Werkzeuge für die Präzisions- und personalisierte Onkologie bewirken wird.

Introduction

Die Entwicklung verschiedener Zweige der Medizin als experimentelle Disziplinen hing von der Fähigkeit ab, Zellpopulationen und Organfunktionen unter kontrollierten Bedingungen zu manipulieren¹. Diese Fähigkeit hat ihre Wurzeln in der Verfügbarkeit messbarer Modelle, die in der Lage sind, Prozesse in unserem Körper zu rekapitulieren.

Im Zeitalter der Immuntherapie und des Einzelzell-Genom-Profilings 2 muss die Krebsbiologie die Vorteile neuer In-vitro- und Computermodelle nutzen, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen ^2,3.

Die Tumormikroumgebung⁴ (TME) ist ein komplexes Gewebe, in dem Krebszellen kontinuierlich mit den anderen zellulären (Immun-, Stroma- und Endothelzellen) und nichtzellulären (extrazelluläre Matrix, EZM) Komponenten interagieren und sich dynamisch weiterentwickeln. Die Dynamik dieser komplexen Landschaft bestimmt, ob Immunzellen als Freund oder Feind bösartiger Zellen fungieren, und beeinflusst so sowohl das Fortschreiten der Krankheit als auch das Ansprechen auf die Therapie stark. Heutzutage laufen große Anstrengungen von Onkoimmunologen, Bioinformatikern und Experten für Systembiologie zusammen, um die klinische Bedeutung der Krebsheterogenität 5,6 entweder räumlich (d. h. in verschiedenen Tumorregionen) und zeitlich (d. h. in unterschiedlichen Tumorprogressionsstadien)^5,6 zu untersuchen und den Phänotyp und die Funktion von Krebs- und Immunzellen auf Einzelzellebene zu charakterisieren. Als Beispiel für diese Synergie werden heute routinemäßig fortschrittliche Computer-Vision-Techniken für die räumliche Kartierung von Immuninfiltrat in histologischen Proben eingesetzt ^7,8.

Neben experimentellen Modellen, die Tierversuche und traditionelle In-vitro-Methoden überbrücken, ermöglichen Fortschritte in der Mikrofluidik und Co-Kultivierungstechniken den Zugang zu verschiedenen Klassen von mikrotechnischen Zellmodellen wie Organoiden, mikrophysiologischen Systemen 9,10,11 (MPS) und Organs-on-Chip^12,13,14 (OOC). Sie haben die gemeinsame Eigenschaft, das “große Ganze” der zellulären Ökosysteme zu vergrößern und das In-vitro-Potenzial zur Kontrolle von Mikroumgebungsfaktoren zu erweitern, während gleichzeitig High-Content-Mikroskopie¹⁵ und Bildverarbeitungsansätze genutzt werden.

Heutzutage haben hochmoderne MPS- und OOC-Systeme begonnen, immunologische Aspekte einzubeziehen und verschiedene Subtypen von Immunzellen in bestehende Gewebe- und Co-Kulturen einzubauen, um eine Vielzahl von Prozessen wie entzündliche Erkrankungen, Wundheilung, Schleimhautimmunität und Reaktion auf Toxine oder tägliche Nahrungsmittel zu erforschen und zu messen¹⁶. Die TME-on-a-Chip-Modelle 10,11,12,13,14,15,16,17, die auch in die perfusierbaren Mikrogefäße 18,19,20,21 integriert sind, wurden entwickelt, um zelltypabhängige Wechselwirkungen, physikalische und chemische Störungen sowie die zytotoxische Aktivität von infiltrierende Lymphozyten²² sowie klinisch relevante immunmodulatorische Wirkstoffe²³.

Hier bieten wir vielseitige Protokolle an, die von Ladezellen in Chips bis hin zu Bildverarbeitungswerkzeugen reichen, um fortschrittliche mikrofluidische Tumor-Immun-Co-Kulturen in 2D- (Abschnitt 1) und 3D- (Abschnitt 2) Umgebungen¹⁶ zu nutzen, die mit der dynamischen, multiparametrischen^{24-Überwachung} und Visualisierung zellulärer Funktionen kompatibel sind. Dies wird unter Beibehaltung der Benutzerfreundlichkeit und Flexibilität sowohl bei der Probenverwaltung als auch bei der Datenanalyse erreicht, wobei die Vorteile der Fidschi-Freeware-Software und ihrer Toolboxen^{genutzt werden 25,26}.

Die in Abschnitt 1 beschriebene mikrofluidische Vorrichtung ist für die Durchführung von 2D-Kokulturen von adhärenten Krebs- und schwebenden Immunzellen ausgelegt. Diese Plattform wurde für die in vitro Messung des Verhaltens von Immunzellen in Gegenwart genetischer Mutationen²⁷ und/oder Immundefekte²⁸ validiert. Hier veranschaulichen wir Schritte zur Verfolgung von Immunzellen in Zeitraffer-Hellfeldbildern, indem wir eine halbautomatische Methode nutzen, die auf Trackmate (einem in Fidschi-Software implementierten Plugin) basiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Extraktion kinematischer Deskriptoren der Immunmigration ²⁹ und der Reaktion (d. h. der Interaktionszeiten) auf Krebszellen, die mit immunogenen Zelltod-Induktoren behandelt wurden oder nicht²⁷.

Wichtig ist, dass diese Parameter, die aus Zeitreihenbildern extrahiert werden, mit fortschrittlichen mathematischen Maschinen verarbeitet werden können. Als Beispiel für die Potenzialität dieses Ansatzes haben unsere Gruppen kürzlich eine Analyse veröffentlicht, die auf mathematischen Methoden aus stochastischen Prozessen und statistischer Mechanik basiert, um zelluläre Netzwerkeigenschaften zu modellieren und eine parametrisierte Beschreibung des Verhaltens von Immunzellen zu liefern (d.h. verzerrter oder unkorrelierter Random Walk, hochgradig oder nicht koordinierte Bewegung^30,31).

Die 3D-Einstellung, die im zweiten Abschnitt vorgestellt wird, basiert auf einem Co-Kultur-Protokoll, um komplexere immunkompetente TMEs, die in zwei Gelregionen mit unterschiedlichen Kombinationen von Zelltypen und Medikamenten eingebettet sind, wettbewerbsfähig nachzubilden. Hier werden Bildverarbeitungsschritte beschrieben, um zu verschiedenen Zeitpunkten die Infiltration von gefärbten Immunzellen in humanen A375M-Melanomzellen, die in Matrigel kultiviert werden, zu messen, um Antitumorwirkstoffkombinationen zu bewerten³². Die A375M-Linie, eine von A375P abgeleitete Zelllinie, die durch einen stark metastasierten Phänotyp gekennzeichnet ist, wurde ausgewählt, um ihre Metastasierungsfähigkeit in Gegenwart von Immunzellen zu bewerten³².

Die beschriebenen Modelle können vollständig mit verschiedenen Zellquellen (murine und humane immortalisierte oder primäre Zelllinien, Organoide, Xenotransplantate usw.) kompatibel sein. In neueren Studien unseres Labors wurde durch die Kombination von High-Content-Videomikroskopie mit Bildanalyse das kompetitive 3D-Layout angewendet, um Folgendes zu untersuchen: i) eine antitumorale (antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, ADCC) Immunantwort und die Rolle von Fibroblasten bei der Resistenz gegen die Trastuzumab-Therapie in HER2⁺ Brustkrebs-On-Chip-Modellen^{zu untersuchen 33}; ii) die Wirkung myeloischer Zellen (d.h. krebsassoziierter Makrophagen) bei Mechanismen der Tumorevasion und Rekrutierung von T-Zellen³⁴; iii) die Wirksamkeit von immuntherapeutischen Regimen, die speziell auf Interferon-α-konditionierten dendritischen Zellen (IFN-DCs) basieren, die mit medikamentös behandelten Darmkrebszellen in Kollagenmatrizen kultiviert werden, und zur Bewertung der effizienten Bewegung und der nachfolgenden Phagozytoseereignisse³⁵; iv) die chemotaktische Migration von aus dem Knochenmark stammenden Eosinophilen zu IL-33-behandelten oder unbehandelten Melanomzellen³⁶.

Diese fortschrittlichen Modelle könnten als Beobachtungsfenster dienen, um die Rolle der Immunkontexture bei Krebsmetastasen und Resistenzmechanismen zu verstehen, aber es sind Anstrengungen erforderlich, um die Ergebnisse in die Kliniken zu übertragen und die Lücke zur Grundlagenforschung zu schließen³⁷.

Die Nutzung der Leistungsfähigkeit der automatisierten High-Content-Mikroskopie in Verbindung mit der Verwendung physiologisch relevanterer Mikrosysteme eröffnet neue potenzielle Herausforderungen für die Handhabung, Verarbeitung und Interpretation von Hunderten und sogar Tausenden von Gigabyte multiparametrischer Daten, die aus einer einzigen experimentellen Kampagne generiert werden können. Dies impliziert eine direkte Verbindung von OOC-Experimenten mit KI-basierten Algorithmen der künstlichen Intelligenz 38,39,40,41,42 (KI) sowohl für die fortgeschrittene automatisierte Analyse als auch für die Generierung von Merkmalen, die wiederum in silico-Modelle des Krebs-Immun-Zusammenspiels⁴³ einfließen können, mit aufregenden neuen Anwendungen am Horizont^, wie z. B.^der Entwicklung von prädiktiven Wirkstoff-Screening-Assays ⁴⁴.

Ein ständig wachsender Fluss von Anstrengungen konzentriert sich auf die Entwicklung von Krankheitsmodellen zusammen mit der Optimierung von Strategien zur Implementierung der groß angelegten Störungsbildschirme mit Einzelzell-Multi-Omics-Auslesungen. Dies wird zweifellos dazu beitragen, einen systematischen Onko-Immunologie-on-a-Chip-Ansatz zu entwickeln und hoffentlich auch klinisch umzusetzen, begleitet von einem angemessenen Grad an Methodenstandardisierung, um neue Einblicke in Immunerkrankungen und Krebsverbreitungsmechanismen zu gewinnen.

Protocol

1. Chip-Design für adhärente und schwimmende Zellen 2D-Co-Kulturen HINWEIS: Das 2D-Co-Kultur-Layout (Abbildung 1A-C) zeichnet sich durch drei Kammern (100 μm hoch) aus, die durch zwei Sätze von Mikrokanal-Arrays (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H) miteinander verbunden sind. Die Zwischenkammer bildet zwei geschlossene Sackgassenkompartimente, die das Überlaufen schwebender Immunz…

Representative Results

Die Tumorimmuninfiltration ist ein Parameter der Anti-Tumor-Reaktion des Wirts. Tumore sind heterogen in Zusammensetzung, Dichte, Lage und Funktionszustand infiltrierender Leukozyten, deren Wechselwirkungen mit Krebszellen klinisch relevanten Informationen zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs und des Ansprechens auf die Therapie zugrunde liegen können. In diesem Sinne könnten mikrofluidische Technologien als komplementäre und privilegierte In-vitro-Werkzeuge eingesetzt werden, um die Immunkontextur von Tumoren zu erf…

Discussion

Die beschriebenen Methoden versuchen, einen allgemeinen Ansatz zu entwickeln, um mit modulierbarem Komplexitätsgrad zwei wichtige Aspekte auf dem Gebiet der Onkoimmunologie zu rekapitulieren, die von der Übernahme relevanterer In-vitro-Modelle profitieren können. Die erste betrifft die Seite der Tumorzellpopulation, wo die Auseinandersetzung mit Einzelzellmerkmalen zu einer besseren Beschreibung der Heterogenität und der korrelierten biologischen und klinischen Bedeutung führen kann, einschließlich Therapieresisten…

Materials

Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator