Der beskrives en metode til bestemmelse af bestøvningskrav i japanske hybrider af blommetypen, som kombinerer felt- og laboratoriebestøvninger og observationer af pollenrør under fluorescensmikroskopi med PCR’s identifikation af S-genotyper og overvågning af blomstringen for udvælgelse af bestøvere.
De japanske blomme sorter almindeligvis dyrkes er interspecifikke hybrider stammer fra krydsninger mellem den oprindelige Prunus salicina med andre Prunus arter. De fleste hybrider udviser gametophytic selv-uforenelighed, som styres af en enkelt og meget polymorf S-locus, der indeholder flere alleler. De fleste dyrkede hybrider er selvkompatible og har brug for pollen fra en kompatibel donor til at befrugte deres blomster. Etablering af bestøvningskrav i japansk blomme bliver stadig vigtigere på grund af det høje antal nye sorter med ukendte bestøvningskrav. I dette arbejde beskrives en metode til bestemmelse af bestøvningskrav i japanske blommelignende hybrider. Selvkompatibilitet bestemmes af håndbestøvninger både i marken og i laboratoriet, efterfulgt af overvågning af pollenrørforlængelse med fluorescensmikroskopi og også overvågning af frugtmodning i marken. Udvælgelse af pollinizer sorter vurderes ved at kombinere identifikationen af S-genotyper ved PCR-analyse med overvågning af blomstringstiden i marken. Kendskab til kultivarernes bestøvningskrav letter udvælgelsen af sorter til design af nye frugtplantager og gør det muligt tidligt at opdage produktivitetsproblemer i forbindelse med bestøvningmangel i etablerede frugtplantager.
Japansk blomme(Prunus salicina Lindl.) er hjemmehørende i Kina1. I det19. århundrede blev denne afgrøde introduceret fra Japan til USA, hvor den blev krydset med andre nordamerikanske diploid blommer2. I det20. århundrede blev nogle af disse hybrider spredt til tempererede regioner rundt om i verden. I dag refererer udtrykket “japansk blomme” til en bred vifte af interspecifikke hybrider afledt af krydsninger mellem den oprindelige P. salicina med op til 15 andre diploide Prunus spp.3,4,5.
Japansk blomme, ligesom andre arter af Rosaceae familien, udstiller Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), som styres af en enkelt og meget polymorf S-locusindeholdende flere alleler6. S-locusindeholder to gener, der koder en ribonuklease (S-RNase) udtrykt i støvvejen, og en F-box protein (SFB) udtrykt i pollen korn7. I selvinkompatibilitet reaktion, når S-allel udtrykt i pollen korn (haploid) er den samme som en af de to udtrykt i pistil (diploid), væksten af pollen rør på tværs af stilen er anholdt på grund af nedbrydningen af pollen rør RNA ved virkningen af S-RNase8. Da denne proces forhindrer befrugtning af den kvindelige gametophyte i ægløsningen, fremmer GSI udskæringen mellem sorter.
Selv om nogle japanske blomme sorter er selvkompatible, de fleste sorter i øjeblikket dyrkes er selvkompatible, og har brug for pollen fra interkompatible donorer til at befrugte deres blomster3. I stenfrugtarter af slægten Prunus som mandel9, abrikos10,11,12 og søde kirsebær13kan bestøvningskrav til sorter bestemmes ved forskellige tilgange. Selvbestøvning af blomster i marken og efterfølgende overvågning af frugtsæt eller ved semi-in vivo-selvbestøvninger under kontrollerede forhold i et laboratorium og observation af pollenrør undermikroskopet 14,15,16,17,18 . Uforenelighedsforhold mellem sorter kan bestemmes ved krydsbestøvninger i marken eller laboratoriet ved hjælp af pollen af den potentielle bestøver-kultivar og ved identifikation af S-alleleraf hver kultivar ved PCR-analyse14,15,16,19,20,21,22 . Hos arter som sød kirsebær eller mandel kan selvkompatibilitet også vurderes ved identifikation af bestemte S-alleler, der er forbundet med selvkompatibilitet, da S4‘ i søde kirsebær13 eller Sf i mandel23.
Flere blommeavlsprogrammer fra de vigtigste producerende lande frigiver en række nye sorter2,14– mange af dem med ukendte bestøvningskrav. I dette arbejde beskrives en metode til bestemmelse af bestøvningskrav i japanske blommelignende hybrider. Selvkompatibilitet bestemmes af selvbestøvninger i både marken og laboratoriet, efterfulgt af observationer af pollenrør under fluorescensmikroskopien. Udvælgelse af pollinizer sorter kombinerer identifikation af S-genotyper ved PCR analyse med overvågning af blomstringstid i marken.
Den metode, der er beskrevet heri for bestøvningskrav hos japanske blomme sorter kræver bestemmelse af selv-(in)kompatibilitet af hver kultivar ved kontrollerede bestøvninger i marken eller laboratoriet, og den efterfølgende observation af pollen rør vækst med fluorescens mikroskopi. Uforenelighedsrelationerne er etableret ved karakteriseringen af S-allelerne ved molekylær genotyping. Endelig er udvælgelsen af pollinizers udføres af overvågning phenology at opdage de sorter, der falder sammen ved bloms…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er finansieret af Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 og RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Den Europæiske Socialfond, Den Europæiske Union (Grupo Consolidado A12-17R) og Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero blev støttet af et stipendium af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología fra México (CONACYT, 471839).
Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
Vortex | Fisherbrand | 11746744 |