Neutronproteinkristallografi är en strukturell teknik som tillåter lokalisering av väteatomer och därmed ger viktiga mekanistiska detaljer om proteinfunktionen. Vi presenterar här arbetsflödet för montering av en proteinkristall, neutrondiffraktionsdatasamling, strukturförfining och analys av kartorna över neutronspridningens längddensitet.
Neutronkristallografi är en strukturell teknik som möjliggör bestämning av väteatotompositioner inom biologiska makromolekyler, vilket ger mekanistiskt viktig information om protonations- och hydreringstillstånd utan att inducera strålningsskador. Röntgendiffraktion ger däremot endast begränsad information om ljusatomers position och röntgenstrålen inducerar snabbt strålningsskador på ljuskänsliga kofaktorer och metallcentra. Presenteras här är arbetsflödet som används för IMAGINE och MaNDi beamlines vid Oak Ridge National Laboratory (ORNL) för att erhålla en neutrondiffraktionsstruktur när en proteinkristall av lämplig storlek (> 0,1 mm3) har odlats. Vi visar montering av hydrerade protein kristaller i kvarts kapillärer för neutron diffraktion datainsamling. Också presenteras ångutbytesprocessen av de monterade kristallerna med D2O-innehållande buffert för att säkerställa ersättning av väteatomer på utbytbara platser med deuterium. Inkorporering av deuterium minskar bakgrunden till följd av osammanhängande spridning av väteatomer och förhindrar densitetsavstängning orsakad av deras negativa sammanhängande spridningslängd. Strategier för insamling av provjustering och insamling av rumstemperaturdata illustreras med hjälp av kvasi-Laue-datainsamling vid IMAGINE vid Högflödesisotoperreaktorn (HFIR). Dessutom demonstreras kristallmontering och snabb frysning i flytande kväve för insamling av kryodata för att fånga labila reaktionsmediärer vid MaNDi-instrumentet vid Spallation Neutron Source (SNS). Förberedelse av modellkoordinerade datafiler och diffraktionsdatafiler och visualisering av SLD-kartor (neutron scattering length density) kommer också att behandlas. Strukturförfining mot neutrondata eller mot gemensamma röntgen-/neutrondata för att erhålla en helt atomstruktur av det intressanta proteinet kommer slutligen att diskuteras. Processen för att bestämma en neutronstruktur kommer att demonstreras med hjälp av kristaller av lytisk polysackaridmonooxygenas Neurospora crassa LPMO9D, ett kopparhaltigt metalloprotein som är involverat i nedbrytningen av motsträviga polysackarider via oxidativ klyvning av glykosidbindningen.
Neutron makromolekylär kristallografi är en teknik som ger ett unikt fönster in i proteiners struktur och underliggande kemi. Konceptuellt lik röntgendiffraktion ger neutrondiffraktion atomistiska detaljer om makromolekylär struktur, men interaktionen mellan neutroner och atomkärnor möjliggör lokalisering av ljusatomer, ofta svåra att upptäcka med röntgendiffraktion1. Under röntgendiffraktion sprids röntgenstrålar från elektronmolnet, vilket gör ljusatomer som väte (H) dåligt synliga i elektrontäthetskartor som inte har nära sub-Ångström-upplösning2. Däremot beror neutronernas spridningsintensitet på komplexa interaktioner med kärnan, med isotoper av samma element som visar olika spridningslängder. Därför har ljusatomer och deras isotoper, såsom väte (1H) och deuterium (2H eller D), jämförbar synlighet med stamnätet kol-, kväve- och syreatomer i kartor över neutronspridningslängd (SLD). Eftersom omfattningen av neutronspridningen är oberoende av antalet elektroner, skyms inte heller spridning från ljuselement av tunga element när de är i närheten av varandra, vilket observeras vid röntgenspridning. Den förbättrade synligheten av H och dess isotop D vid användning av neutrondiffraktion ger värdefull information om protonationstillståndet hos katalytiskt viktiga rester, kofaktorer och ligands och hjälper orienteringen av vattenmolekyler, vilket avslöjar viktig information om katalytiska mekanismer och proteinkemi3. Neutrondiffraktion erbjuder också fördelen av att vara en icke-destruktiv teknik, särskilt lämpad för biologiska prover som är känsliga för jonisering som proteiner med metallcentra eller ljuskänsliga redox-cofactors2. Det primära fokuset för denna artikel är att ge en översikt över arbetsflödet för att erhålla en högkvalitativ neutronproteinkristallstruktur. Vi hänvisar den intresserade läsaren till Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 och O’Dell et al.3 för en utmärkt översikt över neutronproteindiffraktion och Ashkar et al.7 för ytterligare tillämpningar av neutronspridning.
Neutroner genereras främst under kärnreaktioner som använder någon av två processer: kärnklyvning vid reaktorkällor eller spallation vid acceleratorbaserade källor8. Reaktorkällor ger en kontinuerlig neutronstråle genom att använda kärnklyvning av 235U-isotopen medan spallation neutronkällor producerar en pulserad neutronstråle genom att bombardera ett mål, till exempel en flytande metall som kvicksilver, med protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, är värd för både en steady-state neutronkälla vid High Flux Isotope Reactor (HFIR) och en 60 Hz pulsad källa vid Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE beamline, som ligger vid HFIR, är en neutrondiffractometer optimerad för biologiska makromolekyler (kompletterande figur 1)10. IMAGINE använder en neutronbildskyltdetektor för att mäta kvasi-Laue-data med hjälp av en smal bandpass i intervallet 2,8 – 4,5 Å från enstaka kristaller med enhetscellskanter <150 Å. Den makromolekylära neutrondiffractometern (MaNDi), belägen vid SNS, är en tof-neutrondiffractometer utrustad med en sfärisk detektormatrisram (DAF) (kompletterande figur 2)11. MaNDi mäter data från enstaka kristaller med enhetscellkanter i intervallet 10 – 300 Å genom att använda en tunable 2 Å-våglängdsbandbredd mellan 2,0 – 6,0 Å12.
Processen att generera neutroner är mycket energikrävande, vilket resulterar i relativt svaga neutronstråleflöde i kontrast till röntgenstråleflöde vid synkrotronkällor13. För att säkerställa tillräckliga signal-till-brus-förhållanden vid datainsamlingen är det nödvändigt att odla kristaller av lämplig storlek och kvalitet14. Vanligtvis behövs kristaller med volymer > 0,1 mm3 för att samla in data med adekvat statistik15. Förutom lägre flöden måste de inneboende egenskaperna hos interaktionen mellan neutroner och provkärnor beaktas16. Neutronernas spridningslängd skiljer sig åt för isotoper av samma element, en egenskap som med fördel kan utnyttjas i små vinklar neutronspridning (SANS) för att maskera eller markera regioner i ett prov – en process som kallas kontrastmatchning17. I diffraktionsexperiment kan den negativa sammanhängande neutronspridningslängden för H (-3.741 fm för 1H) leda till annullering av neutronspridningstäthetskartitetsfunktioner eftersom de sammanhängande neutronspridningslängderna hos andra biologiskt relevanta atomer, inklusive kol (6,6511 fm för 12C), kväve (9,37 fm för 14N), syre (5,803 fm för 16O), fosfor (5,13 fm för 31P) och svavel (2,804 fm för 32S) är positiva (tabell 1)12,14. Dessutom ökar den stora inkonsekventa spridningslängden på H (25.274 fm), bakgrunden under datainsamlingen, vilket hämmar datamängdens kvalitet och äventyrar dataupplösningen7. För att kringgå dessa begränsningar som införts av H är det nödvändigt att för neutrondiffraktion byta H mot dess isotopdeuterium, 2H(D), som har en positiv sammanhängande neutronspridningslängd (6,671 fm) och betydligt lägre osammanhängande spridningslängd (4,04 fm)19. Detta kan uppnås genom perdeuteration, en process där proteinet uttrycks av organismer som odlas i fullt deutererade medier som säkerställer fullständigt införlivande av D på H-platser20. Det är också möjligt att delvis deuterera protein genom att ersätta H med D enbart på de utbytbara platserna (titrerbara grupper) medan de icke utbytbara kolbundna platserna förblir hydrerade21. Detta kan uppnås genom tillväxt av hydrerade proteinkristaller i deutererad moderlut22. Vanligast är dock att H/D-utbyte av hydrerade proteiner utförs genom ångväxling efter tillväxt av lämpligt stora kristaller i H2O-baserad buffert23. I sådana fall monteras kristaller i en kvarts kapillär och ångkvilibreras med en D20-baserad moderlut.
De begränsade neutronflödena vid neutronkällor resulterar i längre datainsamlingstider, från dagar till flera veckor24. På ORNL använder både IMAGINE och MaNDi en smal våglängdsbandpass i intervallet 2–6 Å för att optimera datainsamlingen25. Data kan samlas in i rumstemperatur eller vid kryotemperatur. Kryo-datainsamling kan potentiellt förbättra datakvaliteten och öppnar upp möjligheten för frysfångstkatalytiska intermediärer. Efter insamling av neutrondiffraktionsdata samlas en röntgendatauppsättning vanligtvis in på samma kristall vid samma temperatur eller på en kristall som odlas under identiska förhållanden26. Datainsamling vid samma temperatur gör det möjligt att utföra strukturförfining mot både röntgen- och neutrondata, vilket förhindrar eventuella temperaturinducerade artefakter, såsom förändringar i vattnets synlighet och position eller beläggning av rester med alternativa konformationer27. Förfining av gemensamma röntgen neutrondata ökar förhållandet mellan data och parameter och ger fördelen att proteinets stamkoordinater kan förfinas mot röntgendata, medan neutrondiffraktionsdata används för att förfina H/D-atomernas position28. Detta är särskilt användbart vid användning av delvis deutererade prover, där densitetsavstängning på grund av H-atomer på icke utbytbara platser på proteinet förekommer. Även om antalet röntgenstrukturer vida överstiger antalet neutronstrukturer som deponeras i Protein Data Bank (PDB), har mjukvarupaket som ursprungligen utformades för förfining av röntgendata utvidgats till att omfatta neutrondata samt3,29,30. Efter datainsamling kan modeller förfinas med hjälp av förfiningspaket som phenix.refine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under förfiningsprocessen kan neutronspridningsdensitetskartor visualiseras för manuell montering med COOT34. Efter strukturlösning kan koordinaterna och neutron- och/eller röntgendiffraktionsdatafilerna skickas till PDB, som validerar och deponerar modellen, vilket gör den tillgänglig för allmänheten18,29,30.
Strukturell analys av proteiner är ett mångfacetterat tillvägagångssätt där många tekniker används för att undersöka deras funktion och mekanism35. Neutronproteinkristallografi ger värdefulla kemiska insikter för att expandera på och komplettera resultaten från ytterligare studier som röntgendiffraktion, spektroskopi, kärnmagnetisk resonans (NMR) eller mikrokristallelektrondiffraktion (microED)36. Neutronproteindiffraktion är unikt positionerat för att ge insikter i enzymatiska mekanismer, eftersom H-atomer är centrala för deras kemi. Frånvaron av strålningsskador orsakade av neutroner gör dem till en sond som är exceptionellt lämpad för studier av metalloproteiner37. Vi presenterar här ett representativt exempel på processen för neutronproteindiffraktion från provberedning till datainsamling, förfining och analys (figur 1). Kristaller av tillräcklig storlek för neutrondiffraktionsexperiment har odlats av metalloproteinet Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D är ett kopparhaltigt metalloprotein som är involverat i nedbrytning av motsträvig cellulosa genom syreatomsinsättning vid glykosidisk bindning38,39. NcLPMO9D aktiva plats innehåller ett mononukleärt koppar centrum inom en karakteristisk “histidin-ortos” bestående av N-terminalen histidin och en andra bevarad histidin (kompletterande figur 3)40. N-terminalen för svamp-LPMOs är metylerad men ändringen efter övergångsövergång sker inte under rekombinant uttryck i jäst. I NcLPMO9D-vilotillståndet är kopparcentret närvarande i ett Cu2 + oxidationstillstånd och aktiveras genom en enda elektronreduktion till Cu1 +, vilket gör att molekylärt syre kan binda och aktiveras genom att snabbt reduceras till en superoxidart41,42. Den totala NcLPMO9D-reaktionen kräver ytterligare tillsats av en elektron och två protoner för att bilda den hydroxylerade polysackaridprodukten43. Identiteten på de aktiverade syrearter som ansvarar för väteatoposuttag (HAA) från polysackaridersubstratet har inte identifierats och intensiva strukturella och beräkningsstudier pågår för närvarande44,45. Med tanke på redoxkemin på nclpmo9D-anläggningen är begränsningen av strålningsskador särskilt relevant. Vi illustrerar här rumstemperatur och kryo-temperatur datainsamling på NcLPMO9D kristaller för att bestämma NcLPMO9D struktur i viloläge och i aktiverad reducerad form, respektive46. Tonvikten kommer att läggas på proteinkristallmontering, strålelineinstrumentinställning för datainsamling, utarbetande av data och koordinatfiler och de förfiningssteg som krävs för att modellera en neutronstruktur av alla atomer.
Neutronproteinkristallografi är en mycket känslig teknik för sondprotonationstillstånd och vattenmolekylorientering i proteiner. Denna information belyser proteinkatalytiska mekanismer eftersom förändringar i protonation och vätebindning interaktioner ofta är centrala för enzymkemi10. Neutronproteinkristallografi, om än en informativ teknik, har ett antal faktorer som bör beaktas innan man planerar att genomföra ett neutrondiffraktionsexperiment, nämligen:
Neutronproteinkristallografi är en fluxbegränsad teknik. I motsats till röntgendiffraktionsdatauppsättningar förväntas högre R-faktorer och lägre fullständighet, redundans och signal-till-brus-förhållanden för neutrondatauppsättningar på grund av teknikens inneboende begränsningar (flux limited, quasi-Laue, längre våglängder). Datainsamlingen för en enda bildruta är vanligtvis 12 –18 timmar. Ett försöks framgång är i hög grad beroende av provstorlek och kvalitet med kristaller på 0,1 mm3 som ofta är minimikravet3. Neutrondiffraktion kräver produktion av stora mängder protein för att sätta upp kristalliseringsdroppar från 10 till 800 μL. Minimivolymen för odling av tillräckligt stora kristaller kan uppskattas med hjälp av en volymkalkylator med tanke på kristall- och provparametrarna (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Tillväxt av stora kristaller har oftast uppnåtts genom ångdiffusion3. Hängande droppkristallisering tillåter tillväxt av kristaller i stora droppar från 10-25 μL, medan större droppar som sträcker sig upp till ~ 50 μL kan ställas in med kommersiellt tillgänglig sittande dropputrustning14,54. Silikoniserade glasplattor med nio brunnar kan användas för att ställa in mycket stora droppar, med volymer upp till 800 μL. Dessa glasplattor placeras i “smörgåslådor” kommersiellt tillgängliga från Hampton Research. Ytterligare kristalliseringstekniker inkluderar batchkristallisering, där gränsen för droppstorleken dikteras av kärlet. Batchkristalliseringsexperiment som kan ställas in kan variera från mikroliter till milliliter55. Kristallisering kan också utföras med hjälp av den dialysteknik där proteinet balanseras med fällningen via ett dialysmembran eller genom motdiffusion längs en utfällbar koncentrationsgradient eller genom en porös plugg som agarose56,57. Sådd erbjuder ett annat alternativ för att få kristaller av önskad volym. Mikro- och makroseding har framgångsrikt använts för stor kristalltillväxt, inklusive stor kristall av NcLPMO9D45. Viss kunskap om proteinfasdiagrammet, inklusive temperaturens inverkan på lösligheten, hjälper till med stor kristalltillväxt.
När du planerar ett neutrondiffraktionsexperiment är optimering av proteinpreparatet för att maximera signal-till-brus-förhållandet under datainsamling av diffraktion7. För att kringgå densitetsavstängning och hög osammanhängande spridning orsakad av H-atomer kan neutron SLD-kartor förbättras genom att byta H-atomer mot dess isotop D, som har en positiv sammanhängande spridningslängd och låg osammanhängande spridningslängd. För att åstadkomma detta utförs ångutbyte av den hydrerade proteinkristallen mot deutererad kristalliseringsbuffert. Detta säkerställer H/D-utbyte av lösningsmedelsmolekyler och det labila, titrerbara proteinet H atomer23. Ångväxling utförs genom montering av den hydrerade kristallen i en kvarts kapillär med D2O-baserade, deutererade kristalliseringsbuffert “pluggar” och det representerar en effektiv, skonsam teknik som oftast appliceras14,23,35. Utbytet kan ta flera veckor och kräver helst att den deutererade bufferten ändras ofta för att säkerställa maximalT H/D-utbyte. H/D-utbyte kan också utföras genom att direkt blötlägga kristallen i deutererad buffert. För att undvika att kristallen utsätts för påfrestningar på grund av D2O-exponering bör blötläggningsprocessen utföras gradvis genom att gradvis öka D2O:H2O-förhållandet58. Utöver detta kan kristallisering av hydrerat protein också utföras i deutererad buffert för H/D-utbyte på labila H-platser22,59. Det bör dock noteras att D2O-baserad buffert har en effekt på proteinlösligheten som kräver ytterligare justering av de kända H2O-baserade förhållandena3,59. D2O-baserade buffertar har också observerats för att leda till mindre kristaller i vissa fall59. Fullständigt utbyte av titrerbara och kolbundna H-atomer till D kan uppnås genom att uttrycka proteiner i deutererade medier för att generera ett perdeutererat prov20. De resulterande neutron-SLD-kartorna över det perdeutererade provet kommer att förbättras avsevärt, vilket inte längre visar densiteten för den hydrerade provmotsvarigheten. Detta är fördelaktigt när man karakteriserar H/D bunden på icke utbytbara platser i ett protein eller kofaktor. Uttryck av perdeutererat protein är dock både högt i kostnad och lågt i utbyte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) erbjuder en deuterationsanläggning för användare som försöker generera ett perdeutererat prov (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeuterated uttryck utförs vanligtvis i en bioreaktor på 1 L-skalan som ger ~ 50 mg renat protein61.
Efter insamlingen av neutrondiffraktionsdata utförs förfining och interaktiv modellbyggnad. Förfining kan köras med flera programvarusviter, inklusive phenix.refine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Phenix-sviten är den vanligaste programvaran för förfining av neutrondiffraktionsdata tillsammans med Coot som används för att manuellt bygga modellen från neutron SLD-kartorna34. Även om både Phenix och Coot tillåter bearbetning av neutrondiffraktionsdata, kan de sakna vissa egenskaper som är nödvändiga för att bearbeta de idiosynkrasier som är associerade med neutrondata och deutererade prover. Coot innehåller till exempel inte geometrioptimering för deutererade rester, vilket kan leda till komplikationer under modellbyggnad eftersom funktionen “Real Space Refine” resulterar i “exploderande” rester (kompletterande figur 26)62. Detta kan lösas genom att generera fasthållningsfiler för alla deutererade rester. Detta är dock en intensiv process och sådana bibliotek är för närvarande inte offentligt tillgängliga. När du utför förbättringar i Phenix, utbytbara H / D platser kommer initialt att ställas in på 0.50 beläggning för H och D. När förbättringar utförs kommer beläggningen av H och D att förfinas enligt neutron SLD-kartorna. Under interaktiv modellbyggnad är Fo-Fc-kartor med skillnadstäthet mycket informativa vid bedömning av H/D-beläggningar. Kartor kan användas för att bestämma vilka platser som har hög D-beläggning, vilket är särskilt informativt på den aktiva platsen där protonationstillstånd är katalytiskt relevanta63. Tvetydiga situationer uppstår dock när H:D beläggningen är nära 0.70:0.30 vilket resulterar i fullständig signalavstängning i neutron SLD-kartor64. Det bör också beaktas att kvasi-Laue neutrondatauppsättningar ofta har fullständighet runt 80%, vilket är lägre än de rutinmässigt observerade ≥ 98% för röntgendiffraktionsdata. Vid raffinering av neutrondiffraktionsdata i Phenix beräknas därför de saknade observerade amplituderna (Fo) från modellen för att slutföra reflektionslistan, vilket introducerar modellbias. För att ta hänsyn till denna potentiella partiskhet bör “no_fill”-kartor undersökas under interaktiv modellbyggnad i motsats till “fyllda” kartor.
Användare kan välja att utföra en gemensam röntgen-/neutrondataförfining av sin struktur, eller en neutrondata endast förfining. Visualisering av neutron SLD-kartor, särskilt vid lägre upplösning, kan inledningsvis vara oroande speciellt för ett hydrerat protein där H fortfarande finns på icke utbytbara platser trots H/D-ångväxling. Detta resulterar i att neutrondensitetskartningen avbryts, vilket ger intrycket av icke-kontinuerliga kartor65,66. Insamling av en motsvarande röntgendatauppsättning kompletterar med fördel dessa avbokningar i en gemensam förfining (figur 13A och figur 13B). En gemensam förfiningsstrategi innebär vanligtvis att förfina proteinets stamkoordinater mot röntgendata, medan neutrondiffraktionsdata används för att förfina H/D-atomernas position och beläggning på utbytbara platser28. Eftersom införandet av gemensam H/D-beläggning på utbytbara platser ökar antalet parametrar som förfinas, ökar en gemensam förfining med röntgendata också förhållandet mellan data och parameter. En gemensam förfining kräver att en motsvarande röntgendatauppsättning samlas in vid samma temperatur på samma kristall eller en kristall som odlas under samma förhållanden. För neutrondiffraktionsdata som samlats in vid rumstemperatur (300K) bör motsvarande röntgendatauppsättning samlas in i rumstemperatur med hjälp av en strategi för insamling av lågdosdata för att begränsa strålningsskador. Perdeutererade prover ger däremot förbättrade och kontinuerliga SLD-neutronkartor eftersom de inte har samma storlek som H/D-signalavstängning. Neutronspridningslängden för vissa grundämnen, inklusive metaller och svavel, gör dem dock dåligt synliga i neutron SLD-kartor, även om proteinet har perdutererats (figur 13C-F)18. Om en metall behöver karakteriseras är det bäst att använda röntgendiffraktion i en gemensam förfining eller tillämpa spektroskopiska tekniker för att komplettera diffraktionsexperiment. Neutrondataförfining utförs ofta när neutrondatauppsättningen har hög upplösning eller om ett perdeutererat protein användes. Dessutom är förfining av neutrondata särskilt användbart om ett protein som är mycket känsligt för strålningsskador studeras, eftersom en röntgenbaserad struktur kan ha strålningsinducerade artefakter. Om en neutrondataförfining ska kunna utföras måste det fastställas om motsvarande neutrondatauppsättning har tillräcklig fullständighet och upplösning.
ORNL erbjuder två anläggningar för insamling av neutrondiffraktionsdata: IMAGINE-strållinjen vid HFIR samt MaNDi-strållinjen vid SNS36,67. Båda instrumenten ger effektiva medel för att samla in en neutrondiffraktionsuppsättning med liknande principer, men varje instrument har unika specifikationer som bör beaktas vid tillämpning av stråltid. IMAGINE samlar in kvasi-Laue-data och är optimerad för insamling av rumstemperaturdata på kristaller med enhetsceller upp till ~100 Å. MaNDi kan användas för insamling av rumstemperings- och kryotemperaturdata som använder TOF-Laue-insamling på kristaller med enhetsceller upp till ~ 300 Å. Innan en fullständig datauppsättning samlas in utförs ett test på kristallen för att utvärdera kvaliteten på det erhållna diffraktionsmönstret där kristallen utsätts för neutronstrålen för en enda ram. Om kristallen är av tillräcklig kvalitet kommer en fullständig neutrondiffraktionsuppsättning att samlas in, indexeras, integreras, skalas och slås samman i en process som är jämförbar med röntgendatabehandling. IMAGINE använder Lauegen och Lscale och MaNDi använder Mantid-paketet och använder tredimensionell profilmontering48,50,51,68,69,70. Forskare som blir användare vid någon av dessa anläggningar kommer att förses med en datauppsättning i MTZ- eller HKL-format för vidare analys.
Neutrondiffraktion är en icke-destruktiv, mycket känslig teknik för att undersöka protonationstillståndet och vätebindningsinteraktioner av biologiska makromolekyler. Det är särskilt användbart för fotokänsliga proteiner och metalloproteiner. Flera överväganden om tekniken samt behandlingen av uppgifterna måste beaktas innan ett experiment genomförs, men resultatet ger resultat som kan ge värdefull inblick i den katalytiska mekanismen hos proteinet av intresse. Neutronproteinkristallografi kompletterar beräknings-, struktur-, biokemiska och spektroskopiska studier, vilket gör det till ett värdefullt verktyg i biologens verktygslåda av tekniker som används för att karakterisera biologiska makromolekyler.
The authors have nothing to disclose.
Proteinuttrycks-, renings- och kristalliseringsexperiment utfördes vid Center for Structural Molecular Biology (CSMB), en amerikansk avdelning för energibiologisk och miljöforskningsanvändaranläggning vid Oak Ridge National Laboratory. Neutrondiffraktionsdata samlades in vid BL-11B MaNDi vid Spallation Neutron Source (SNS) vid ORNL som sponsras av Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Författarna tackar Brendan Sullivan för hjälp med datareduktion. Röntgendiffraktionsdata samlades in vid METRIC-anläggningarna (Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center) vid North Carolina State University, som stöds av delstaten North Carolina. GCS bekräftar delvis stöd från National Research Foundation (NRF), Sydafrika och Graduate Opportunities (GO!) -programmet vid ORNL. FM bekräftar stöd från USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |