Her presenterer vi en protokoll for å undersøke virkningene av hydraulisk oppsprekking på nærliggende bekker ved å analysere deres vann- og sedimentmikrobielle samfunn.
Hydraulisk oppsprekking (HF), ofte kalt “fracking”, bruker en blanding av høytrykksvann, sand og kjemikalier for å sprekke bergarter, frigjøre olje og gass. Denne prosessen revolusjonerte den amerikanske energiindustrien, da den gir tilgang til ressurser som tidligere var uoppnåelige og nå produserer to tredjedeler av den totale naturgassen i USA. Selv om fracking har hatt en positiv innvirkning på den amerikanske økonomien, har flere studier fremhevet de skadelige miljøeffektene. Av spesiell bekymring er effekten av fracking på headwater bekker, som er spesielt viktig på grunn av deres uforholdsmessig store innvirkning på helsen til hele vannskillet. Bakteriene i disse bekkene kan brukes som indikatorer på strømhelse, da bakteriene som er tilstede og deres overflod i en forstyrret strøm forventes å avvike fra de i en ellers sammenlignbar, men uforstyrret strøm. Derfor tar denne protokollen sikte på å bruke bakteriesamfunnet for å avgjøre om strømmer har blitt påvirket av fracking. Til dette formål må sediment- og vannprøver, fra bekker nær fracking (potensielt påvirket) og oppstrøms eller i et annet vannskille av fracking aktivitet (uhindret) samles inn. Disse prøvene blir deretter utsatt for nukleinsyreutvinning, bibliotekforberedelse og sekvensering for å undersøke mikrobiell samfunnssammensetning. Korrelasjonsanalyser og maskinlæringsmodeller kan deretter brukes til å identifisere hvilke funksjoner som er forklarende for variasjon i samfunnet, samt identifisering av prediktive biomarkører for frackings innvirkning. Disse metodene kan avdekke en rekke forskjeller i de mikrobielle samfunnene blant hovedvannsstrømmer, basert på nærhet til fracking, og tjene som grunnlag for fremtidige undersøkelser om miljøpåvirkningen av fracking-aktiviteter.
Hydraulisk oppsprekking (HF), eller “fracking”, er en metode for utvinning av naturgass, som har blitt stadig mer utbredt etter hvert som etterspørselen etter fossilt brensel fortsetter å øke. Denne teknikken består av å bruke kraftig boreutstyr for å injisere en blanding av vann, sand og kjemikalier i metanrike skiferavsetninger, vanligvis for å frigjøre fanget gasser1.
Fordi disse ukonvensjonelle høstingsteknikkene er relativt nye, er det viktig å undersøke effekten av slike praksiser på nærliggende vannveier. Fracking aktiviteter mandat rydding av store swaths av land for utstyr transport og brønn pad konstruksjon. Omtrent 1,2-1,7 hektar land må ryddes for hver brønnpute2, noe som potensielt kan påvirke avrenning og vannkvalitet på systemet3. Det er mangel på åpenhet rundt den eksakte kjemiske sammensetningen av fracking væske, inkludert hvilke biocider som brukes. I tillegg har fracking avløpsvann en tendens til å være svært saltvann2. Videre kan avløpsvannet inneholde metaller og naturlig forekommende radioaktive stoffer2. Derfor er muligheten for lekkasjer og søl av fracking væske på grunn av menneskelig feil eller utstyrsfeil bekymret.
Stream økosystemer er kjent for å være svært følsomme for endringer i omkringliggende landskap4 og er viktige for å opprettholde biologisk mangfold5 og riktig næringssykling6 innenfor hele vannskillet. Mikrober er de mest tallrike organismene i ferskvannsstrømmer, og er derfor avgjørende for næringssykling, biologisk nedbrytning og primærproduksjon. Mikrobiell samfunnssammensetning og funksjon tjener som gode verktøy for å få informasjon om økosystemet på grunn av deres følsomhet for perturbance, og nyere forskning har vist tydelige endringer i observerte bakterielle sammenstillinger basert på nærhet til fracking aktivitet7,8. For eksempel ble Beijerinckia, Burkholderiaog Methanobacterium identifisert som beriket i bekker nær fracking mens Pseudonocardia, Nitrospiraog Rhodobacter ble beriket i bekkene ikke i nærheten av fracking7.
Neste generasjons sekvensering av 16S ribosomal RNA (rRNA) genet er en rimelig metode for å bestemme bakteriell samfunnssammensetning som er raskere og billigere enn hele genomsekvensering nærmer seg9. En vanlig praksis innen molekylær økologi er å bruke den svært variable V4-regionen i 16S rRNA-genet for sekvenseringsoppløsning, ofte ned til slektsnivå med et bredt spekter av identifikasjon9, da det er ideelt for uforutsigbare miljøprøver. Denne teknikken har blitt implementert mye i publiserte studier og har blitt brukt til å identifisere virkningen av fracking operasjoner på vannmiljøer7,8. Det er imidlertid verdt å merke seg at bakterier har varierende kopitall av 16S rRNA-genet, noe som påvirker deres oppdagede overflod10. Det er noen få verktøy for å gjøre rede for dette, men deres effekt er tvilsom10. En annen praksis som raskt vokser i utbredelse og mangler denne svakheten er metatranskriptomisk sekvensering, der alle RNA er sekvensert, slik at forskere kan identifisere både aktive bakterier og deres genuttrykk.
I motsetning til metoder i tidligere publiserte studier7,8,11,12, dekker denne protokollen derfor også utvalgsinnsamling, bevaring, behandling og analyse for å undersøke mikrobiell fellesskapsfunksjon (metatranscriptomics). Trinnene som er beskrevet her, gjør det mulig for forskere å se hvilken innvirkning, om noen, fracking har hatt på genene og veiene uttrykt av mikrober i sine bekker, inkludert antimikrobielle resistensgener. Dessuten er detaljnivået som presenteres for prøveinnsamling forbedret. Selv om flere av trinnene og notatene kan virke åpenbare for erfarne forskere, kan de være uvurderlige for de som nettopp har startet forskningen.
Her beskriver vi metoder for prøveinnsamling og prosessering for å generere bakterielle genetiske data som et middel til å undersøke virkningen av fracking på nærliggende bekker basert på laboratorienes flere års erfaring. Disse dataene kan brukes i nedstrømsprogrammer for å identifisere forskjeller som tilsvarer fracking-status.
Metodene beskrevet i denne artikkelen er utviklet og raffinert i løpet av flere studier publisert av vår gruppe mellom 2014 og 20187,8,10 og har blitt brukt med hell i et samarbeidsprosjekt for å undersøke virkningene av fracking på vannsamfunn i et treårig prosjekt som snart vil sende inn en artikkel for publisering. Disse metodene vil fortsatt bli benyttet i løpet av resten av prosjektet. I tillegg beskriver annen aktuell litteratur som undersøker virkningen av fracking på bekker og økosystemer lignende metoder for utvalgsinnsamling, behandling og analyse7,8,10,11. Imidlertid brukte ingen av disse papirene metatranskriptomisk analyse, noe som gjorde denne artikkelen den første til å beskrive hvordan disse analysene kan brukes til å belyse frackings innvirkning på nærliggende bekker. Videre er metodene som presenteres her for prøveinnsamling mer detaljerte, og det samme er trinnene som er tatt for å unngå forurensning.
Et av de viktigste trinnene i protokollen vår er første prøveinnsamling og bevaring. Feltprøvetaking og -innsamling har visse utfordringer, da det kan være vanskelig å opprettholde et aseptisk eller sterilt miljø under innsamling. I løpet av dette trinnet er det viktig å unngå forurensende prøver. For å gjøre dette, bør hansker brukes, og bare sterile beholdere og verktøy bør få lov til å komme i kontakt med prøver. Prøver bør også umiddelbart plasseres på is etter innsamling for å redusere nukleinsyreforringelse. Å legge til et kommersielt nukleinsyre konserveringsmiddel ved innsamling kan også øke nukleinsyreutbyttet og tillate at prøver lagres i lengre perioder etter innsamling. Når nukleinsyreutvinning utføres, er det viktig å bruke riktig mengde prøve, for mye kan tette spinnfiltre som brukes til utvinning (for de protokollene som bruker dem), men for lite kan resultere i lave utbytter. Pass på at du følger instruksjonene for det settet som brukes.
I likhet med feltinnsamling er det også viktig å unngå eller minimere forurensning under nukleinsyreutvinning og prøvepreparering, spesielt når du arbeider med lave nukleinsyreutbytteprøver, for eksempel suboptimale sedimentprøver (prøver som inneholder en stor mengde grus eller bergarter) eller vannprøver. Derfor, som med prøveoppsamling, bør hansker brukes under alle disse trinnene for å redusere forurensning. I tillegg bør alle arbeidsflater som brukes under laboratorieprosedyrer steriliseres på forhånd ved å tørke av med en 10% blekemiddelløsning, etterfulgt av en 70% etanoloppløsning. For pipetteringstrinn (3-6) bør filterspisser brukes til å unngå forurensning på grunn av selve pipetten, med spisser som endres hver gang de berører en ikke-steril overflate. Alle verktøy som brukes til laboratoriearbeid, inkludert pipetter, bør tørkes av før og etter med blekemiddel- og etanolløsningene. For å evaluere forurensning bør ekstraksjonsemner og negativer (steril væske) inkluderes under hvert sett med nukleinsyreekstraksjoner og PCR-reaksjoner. Hvis kvantifisering etter ekstraksjon avslører en påviselig mengde DNA/RNA i negativene, kan ekstraksjoner gjentas hvis det er tilstrekkelig prøve igjen. Hvis negative prøver for PCR viser forsterkning, bør feilsøking utføres for å bestemme kilden, og deretter bør prøvene kjøres på nytt. For å ta hensyn til lave nivåer av forurensning, anbefales det at ekstraksjonsemner og PCR-negativer sekvenseres slik at forurensningene kan identifiseres og fjernes, om nødvendig, under beregningsanalyse. På den annen side kan PCR-forsterkning også mislykkes på grunn av en rekke årsaker. For miljøprøver er hemming av PCR-reaksjonen ofte skyldige, noe som kan skyldes en rekke stoffer som forstyrrer Taq polymerase23. Hvis det mistenkes hemming, kan PCR-vann (se Materialfortegnelse) brukes til å fortynne DNA-ekstraktene.
Denne protokollen har noen få bemerkelsesverdige begrensninger og potensielle vanskeligheter. Prøvetaking kan være utfordrende for både vann- og sedimentprøver. For å få nok biomasse, må ideelt 1 L av bekkevann skyves gjennom et filter. Porene i filteret må være små for å fange mikrober, men kan også fange opp sediment. Hvis mye sediment er i vannet på grunn av nylig nedbør, kan filteret tette, noe som gjør det vanskelig å skyve hele volumet gjennom filteret. For sedimentinnsamling kan det være utfordrende å estimere dybden av sediment under innsamling. Videre er det viktig å sikre at sedimentet som samles inn hovedsakelig er jord, da småstein og bergarter vil føre til lavere nukleinsyreutbytte og kanskje ikke være en nøyaktig representasjon av det mikrobielle samfunnet. Til slutt er det også viktig at prøver holdes på is etter innsamling, spesielt hvis et konserveringsmiddel ikke brukes.
Selv om denne protokollen dekker både metatranscriptomics og 16S labprotokoller, bør det understrekes at disse to metodene er svært forskjellige i både prosessen og i typen data de gir. 16S rRNA-genet er en ofte målrettet region, høyt bevart i bakterier og arkaea, og nyttig for å karakterisere bakteriesamfunnet i en prøve. Selv om det er en målrettet og spesifikk tilnærming, er oppløsning på artsnivå ofte uoppnåelig, og karakterisering av nylig divergerte arter eller stammer er vanskelig. Derimot er metatranscriptomics en bredere tilnærming som fanger opp alle aktive gener og mikrober som er tilstede i en prøve. Mens 16S bare gir data for identifisering, kan metatranscriptomics gi funksjonelle data som uttrykte gener og metabolske veier. Begge er verdifulle, og når de kombineres, kan de avsløre hvilke bakterier som er til stede og hvilke gener de uttrykker.
Denne artikkelen beskriver metoder for feltinnsamling og prøvebehandling for både 16S rRNA og metatranskriptomiske analyser i sammenheng med studier av fracking. I tillegg beskriver den innsamlingsmetoder for DNA / RNA av høy kvalitet fra lave biomasseprøver og for langsiktig lagring. Metodene som er beskrevet her er kulminasjonen av våre erfaringer med prøveinnsamling og prosessering i vår innsats for å lære hvordan fracking påvirker nærliggende bekker gjennom å undersøke strukturen og funksjonen til deres mikrobielle samfunn. Mikrober reagerer raskt på forstyrrelser, og følgelig kan hvilke mikrober som er til stede og genene de uttrykker gi informasjon om effekten av fracking på økosystemer. Samlet sett kan disse metodene være uvurderlige i vår forståelse av hvordan fracking påvirker disse viktige økosystemene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringskildene for prosjektene som førte til utviklingen av disse metodene, med disse kildene: Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) gjennom Precollege and Undergraduate Science Education Program, samt av National Science Foundation (http://www.nsf.gov) gjennom NSF-priser DBI-1248096 og CBET-1805549.
200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |