Målet med denne protokollen er å vise hvordan man utfører en forbedret analyse for mekanisk nociception i Drosophila larver. Vi bruker analysen her for å demonstrere at mekanisk overfølsomhet (allodynia og hyperalgesi) eksisterer i Drosophila larver.
Publiserte analyser for mekanisk nociception i Drosophila har ført til variable vurderinger av atferd. Her fabrikkerte vi, for bruk med Drosophila larver, tilpassede metall nikkel-titanlegering (nitinol) filamenter. Disse mekaniske sondene ligner på von Frey-filamentene som brukes i virveldyr for å måle mekanisk nociception. Her viser vi hvordan du lager og kalibrerer disse mekaniske sondene og hvordan du genererer en full atferdsdoserespons fra subthreshold (uskyldig eller ikke-skadelig område) for å suprathreshold (lav til høy skadelig rekkevidde) stimuli. For å demonstrere nytten av sondene undersøkte vi vevsskadeindusert overfølsomhet i Drosophila larver. Mekaniske allodynia (overfølsomhet overfor en normalt uskyldig mekanisk stimulans) og hyperalgesi (overdrevet respons på en skadelig mekanisk stimulans) er ennå ikke etablert i Drosophila larver. Ved hjelp av mekaniske sonder som normalt er uskyldige eller sonder som vanligvis fremkaller en aversiv oppførsel, fant vi at Drosophila larver utvikler mekanisk hypersenssibilisering (både allodynia og hyperalgesi) etter vevsskade. Dermed vil de mekaniske sondene og analysene som vi illustrerer her sannsynligvis være viktige verktøy for å dissekere de grunnleggende molekylære / genetiske mekanismene for mekanisk overfølsomhet.
Drosophila larver viser en karakteristisk aversiv rullende oppførsel når de utsettes for forskjellige skadelige stimuli: termisk1,mekanisk 2og kjemisk3. Denne virkemåten er tydelig forskjellig fra normal bevegelse. Her beskriver vi en forbedret mekanisk analyse som kan brukes til å vurdere mekanisk nociception og mekanisk sensibilisering.
I en fersk studie fabrikkerte vi von Frey-lignende filamenter ved hjelp av nitinolledninger4. Prober som utøver forskjellige krefter og trykk ble gjort ved å variere lengdene og diameteren på nitinolledningene som danner hver sonde. Mekaniske prober ble kalibrert og de målte kraftverdiene (i millinewton, mN) ble konvertert til trykk (kilopascal, kPa), basert på spissen av hver sonde4. Tilpasset fabrikasjon av mekaniske sonder tillatt for oss å generere subthreshold (≤200 kPa) til suprathreshold (225 kPa til 5318 kPa) trykk, som i prinsippet kan være gunstig for å studere mekanisk overfølsomhet. Ved hjelp av disse forbedrede mekaniske von Frey-lignende filamenter viste vi at trykk4, i motsetning til den tidligere undersøkte kraften2,5,6 korrelerer mer konsekvent med aversiv atferdsrespons i Drosophila larver. Den forbedrede mekaniske analysen beskrevet her bidro også til å identifisere en bevart vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF)-relatert reseptor tyrosin kinase signaliserer en vei som regulerer mekanisk nociception hos fluer og rotter4.
Mekanisk allodynia og hyperalgesi, to modaliteter av overfølsomhet, er relativt understudert i Drosophila larver, sammenlignet med termisk (varme og kulde) og kjemiske sensoriske modaliteter3,7,8,9,10. Dette skyldes sannsynligvis mangelen på spesifikke mekaniske sonder som spenner fra uskyldige stimuli til det høye skadeligeområdet 2,5,6. En normalt uskyldig stimulans som fremkaller den typiske aversive rullende oppførselen etter Drosophila larver opplever vevsskade3,7 kalles allodynia. En overdrevet rullende respons på en typisk skadelig stimulans er kjent som hyperalgesi7. Skadelige stimuli er definert som de som fremkaller vevsskade og kan aktivere nociceptors11. Skadelige stimuli levert til Drosophila larver skader enten barriereeppidermis, perifere nociceptive sensoriske nevroner3,4,7eller begge deler.
I denne artikkelen demonstrerer vi hvordan du tilpasser diktering og kalibrerer von Frey-lignende mekaniske sonder som passer for Drosophila larver. Videre viser vi hvordan du bruker disse sondene til å analysere mekaniske nociceptive responser i Drosophila larver. Til slutt demonstrerer vi ytterligere nytten av disse sondene ved å bruke dem til å demonstrere tilstedeværelsen av mekanisk overfølsomhet, både allodynia og hyperalgesi, etter vevsskade i Drosophila larver (se Representative Results).
Vi endret en etablert mekanisk analyse1,2,16 ved hjelp av tilpassede mekaniske sonder fabrikkert fra nitinol filamenter. Denne metalllegeringen tillater oss å bruke filamenter med mindre diameter som passer til størrelsen på Drosophila larver. Fiskesnørebaserte monofilamenter har dominert feltet av flue mekanisk nociceptiontil dags dato 2,5,6,16. Våre nitinolfilamenter opprettholder sin form og målte trykk i ca ~ 3-5 måneder (etter vår erfaring). Ved å variere lengden og diameteren på nitinolfilamenter, kan brukeren generere et bredt spekter av trykk som strekker seg fra subthreshold til en nesten fullstendig rullende respons. Spesielt er det enklere å lage subthreshold-sonder med nitinolfilamenter med mindre diameter. Ved hjelp av disse sondene fant vi at trykket, i stedet for å tvinge, fremkaller mer konsekvente nocifensive atferdsresponser4. Vi demonstrerer her, ved hjelp av en veletablert UV-indusert nociceptive sensibiliseringsmodell7,10,13, at disse filamentene også er et nyttig verktøy for å studere mekanisk overfølsomhet – allodynia og hyperalgesi.
Tidligere studier ved hjelp av mekaniske sonder fabrikkert fra fiskesnøre har ført til en viss variasjon i atferdsrespons2,6,16,17. Flere faktorer kan ta høyde for dette. For det første, fordi trykket er den viktige variabelen, er polering av filamentspissen slik at den avrundes og ikke har noen skarpe kanter kritisk. For det andre er rapportering av trykkverdier i stedet for bare kraft viktig for reproduserbarheten av eksperimentene, fordi forskjellige mekaniske sonder som genererer lignende krefter, kan fremkalle ulike trykk4. For det tredje er det viktig å bruke bare en mekaniskstimulering per larve ved hjelp av skadelige sonder, fordi slike sonder produserer en doseavhengig vevsskade på epidermal 4 og sensoriske nevronale nivåer (figur 2E). En annen eller påfølgende skadelig mekanisk stimulans, etter at vevsskade er indusert, kan tenkes å svekke funksjonen til de berørte perifere sensoriske nevroner og fremkalle en endret atferdsrespons. I en annen studie stimulert larver to ganger med skadelige mekaniske sonder, viste for det meste en forbedret atferdsrespons5, noe som tyder på utvikling av en akutt mekanisk sensibilisering (hyperalgesi), som kan skyldes vevsskaden provosert av den første skadelige mekaniske stimulansen. Omvendt rapporterte andre forfattere6 en blandet (økt eller redusert) atferdsrespons, noe som indikerer at den endrede atferdsresponsen kan skyldes skade/dysfunksjon av det nevronale vevet. Stimulere hver larve bare en gang eliminerer mulig varians i atferdsresponser som følge av sensibilisering eller vevsskade. For det fjerde stimulerte vi mekanisk segmentet A8, som er mer bakre enn tidligere studier (foretrukne områder A3–A4)2,5,16. Prober mellom ~ 3900 kPa og 5300 kPa brukt på enten segment A2 eller A8 viste ingen atferdsforskjeller4. I tillegg er A8, sammenlignet med A2–A4, lettere å stimulere med mekaniske prober som genererer lavere trykk (< 300 kPa) fordi larven er tynnere i denne regionen og dermed lettere komprimert. Andre studier viste at skadelig mekanisk stimulering av den bakre enden av larven (levert av en stiv insektpinne, holdt med tang) for det meste fremkalt frem bevegelse, snarere enn en aversiv eller rullende respons18. Denne forskjellige atferdsresponsen kan skyldes forskjeller i egenskapene til de brukte materialene (bøyelig nitinolfilament vs ukomprimerbar insektpinne) eller til forskjellige trykk levert til larver (trykkverdien av insektpinnen ble ikke rapportert).
Utviklingen av en mekanisk nociception analyse for Drosophila larver har gjort det mulig for feltet å oppdage at ulike mekaniske sensoriske iionkanaler og nevrale kretser medierer mekanisk nociception5,6,16,17. Studien av den mekaniske overfølsomheten (allodynia og hyperalgesi) har imidlertid ligget, sammenlignet med sensibilisering av de andre sensoriske modalitetene – varme7,8,10,13,14,kald9og kjemisk3. Dette etterslepet kan delvis skyldes fraværet av egnede mekaniske sonder som kan generere et komplett responsområde som strekker seg over understrekk for å suprathreshold press. Av særlig betydning, spesielt for å vurdere mekaniske allodynia, er subthreshold sonder som ikke fremkaller en aversiv rullende respons fra uskadede larver. Betydningen av våre forbedrede mekaniske sonder er at de kan fremstilles for å strekke seg over uskyldige stimuli (subthreshold ~ 174 kPa-200 kPa) eller det lave til høye skadelige området (suprathreshold ~ 225 kPa til ~ 5116 kPa). Her demonstrerer vi ved hjelp av nitinol von Frey-lignende filamenter at Drosophila larver utvikler både mekanisk allodynia og mekanisk hyperalgesi etter UV-bestråling. Den mekaniske sensibiliseringen viser noen forskjeller sammenlignet med termisk sensibilisering. Både utbruddet og toppen av mekanisk sensibilisering er tidligere (~ 4 h) sammenlignet med termisk (varme) sensibilisering (~ 8 h for hyperalgesi og ~ 24 h for allodynia)7. I tillegg er den mekaniske allodynia og hyperalgesi samtidig (begge topper på ~ 4 timer). Videre, mens varmesensibilisering (allodynia og hyperalgesi) løser seg helt på senere tidspunkt7, viste mekanisk overfølsomhet en lang hale som forble litt over baseline. Kald sensibilisering i Drosophila innebærer en bryter i kald-fremkaltatferd 9 og fremveksten av ny kald-fremkalt atferd-et fenomen som ikke observeres med mekanisk stimulering. Disse forskjellene i utbruddet, varigheten og observert atferd tyder på at hver sensorisk modalitet kan kontrolleres av forskjellige signalveier. Kombinere sensibilisering analyse beskrevet her med de kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila bør tillate en presis genetisk disseksjon av mekanisk overfølsomhet (allodynia og hyperalgesi) observert.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Thomas Wang for å ha utviklet prototypen von Frey filamenter, Patrick J. Huang for å forbedre den mekaniske sondeanalysen, Bloomington Drosophila Stock Center for kontrollen (w1118) og ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP flylagre, og Galko labmedlemmer for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av R21NS087360 og R35GM126929 til MJG.
Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |