Målet med detta protokoll är att visa hur man utför en förbättrad analys för mekanisk nociception i Drosophila larver. Vi använder analysen här för att visa att mekanisk överkänslighet (allodyni och hyperalgesi) finns i Drosophila larver.
Publicerade analyser för mekanisk nociception i Drosophila har lett till varierande bedömningar av beteende. Här tillverkade vi, för användning med Drosophila larver, anpassade metall nickel-titanlegering (nitinol) filament. Dessa mekaniska sonder liknar de von Frey filament som används i ryggradsdjur för att mäta mekanisk nociception. Här visar vi hur man gör och kalibrerar dessa mekaniska sonder och hur man genererar ett fullständigt beteendemässiga dossvar från subthreshold (harmlöst eller icke-skadligt intervall) till suprathreshold (låg till hög skadlig räckvidd) stimuli. För att visa nyttan av sonderna undersökte vi vävnadsskadad överkänslighet i Drosophila larver. Mekanisk allodyni (överkänslighet mot en normalt harmlös mekanisk stimulans) och hyperalgesi (överdriven lyhördhet för en skadlig mekanisk stimulans) har ännu inte fastställts i Drosophila larver. Med hjälp av mekaniska sonder som normalt är harmlösa eller sonder som vanligtvis framkallar ett aversivt beteende fann vi att Drosophila larver utvecklar mekanisk överkänslighet (både allodyni och hyperalgesi) efter vävnadsskada. Således kommer de mekaniska sonder och analyser som vi illustrerar här sannolikt att vara viktiga verktyg för att dissekera de grundläggande molekylära/genetiska mekanismerna för mekanisk överkänslighet.
Drosophila larver uppvisar ett karakteristiskt aversivt rullande beteende när de utsätts för olika skadliga stimuli:termisk 1,mekanisk 2, och kemisk3. Detta beteende skiljer sig tydligt från normal rörelse. Här beskriver vi en förbättrad mekanisk analys som kan användas för att bedöma mekanisk nociception och mekanisk sensibilisering.
I en ny studie tillverkade vi von Frey-liknande filament med nitinoltrådar4. Sonder som utövar olika krafter och tryck gjordes genom att variera längder och diametrar av nitinoltrådarna som bildar varje sond. Mekaniska sonder kalibrerades och de uppmätta kraftvärdena (i millinewton, mN) omvandlades till tryck (kilopascal, kPa), baserat på spetsområdet för varje sond4. Anpassad tillverkning av mekaniska sonder tillät oss att generera subthreshold (≤200 kPa) till suprathreshold (225 kPa till 5318 kPa) tryck, vilket i princip kan vara fördelaktigt för att studera mekanisk överkänslighet. Med hjälp av dessa förbättrade mekaniska von Frey-liknande filament visade vi att tryck4, i motsats till den tidigare undersöktakraften 2,5,6 korrelerar mer konsekvent med aversiv beteenderesponsivitet hos Drosophila larver. Den förbättrade mekaniska analysen som beskrivs här hjälpte också till att identifiera en bevarad vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)-relaterad receptor tyrosinkinas som signalerar en väg som reglerar mekanisk nociception hos flugor och råttor4.
Mekanisk allodyni och hyperalgesi, två former av överkänslighet, är relativt understudie i Drosophila larver, jämfört med termiska (värme och kyla) och kemiska sensoriska modaliteter3,7,8,9,10. Detta beror förmodligen på bristen på specifika mekaniska sonder som sträcker sig från harmlösa stimuli till det höga skadliga intervallet2,5,6. En normalt harmlös stimulans som framkallar det typiska aversiva rullande beteendet efter Att Drosophila larver upplever vävnadsskada 3,7 kallas allodynia. Ett överdrivet rullande svar på en typiskt skadlig stimulans kallas hyperalgesi7. Skadliga stimuli definieras som de som framkallar vävnadsskador och kan aktivera nociceptorer11. Skadliga stimuli levereras till Drosophila larver skada antingen barriär epidermis, perifera nociceptiva sensoriska nervceller3,4,7, eller båda.
I den här artikeln visar vi hur man skräddarsyr och kalibrerar von Frey-liknande mekaniska sonder som är lämpliga för Drosophila larver. Vidare visar vi hur man använder dessa sonder för att analysera mekaniska nociceptiva svar i Drosophila larver. Slutligen visar vi vidare nyttan av dessa sonder genom att använda dem för att visa förekomsten av mekanisk överkänslighet, både allodyni och hyperalgesi, efter vävnadsskador i Drosophila larver (se representativa resultat).
Vi modifierade en etablerad mekanisk analys1,2,16 med hjälp av anpassade mekaniska sonder tillverkade av nitinoltrådar. Denna metalllegering gör det möjligt för oss att använda filament med mindre diameter som är lämpliga för storleken på Drosophila larverna. Fiske linje-baserade monofilaments har dominerat fältet för flyga mekanisk nociception hittills2,5,6,16. Våra nitinolfilament bibehåller sin form och uppmätt tryck i cirka ~ 3-5 månader (enligt vår erfarenhet). Genom att variera längden och diametern på nitinolfilamenten kan användaren generera ett brett spektrum av tryck som sträcker sig från subthreshold till ett nästan komplett rullande svar. I synnerhet är det enklare att göra subthreshold-sonder med nitinolfilament med mindre diameter. Med hjälp av dessa sonder fann vi att tryck, snarare än kraft, framkallar mer konsekventa nocifensiva beteendemässiga svar4. Vi demonstrerar här, med hjälp av en väletablerad UV-inducerad nociceptiv sensibiliseringsmodell7,10,13, att dessa filament också är ett användbart verktyg för att studera mekanisk överkänslighet – allodyni och hyperalgesi.
Tidigare studier med mekaniska sonder tillverkade av fiskelina har lett till en viss variation ibeteenderesponsivitet 2,6,16,17. Flera faktorer kan förklara detta. För det första, eftersom tryck är den viktiga variabeln, är polering av glödtrådsspetsen så att den är rundad och inte har några skarpa kanter avgörande. För det andra är rapportering av tryckvärden snarare än bara kraft viktigt för experimentens reproducerbarhet, eftersom olika mekaniska sonder som genererar liknande krafter kan framkalla olika tryck4. För det tredje är det viktigt att endast tillämpa en mekanisk stimulering per larv med hjälp av skadliga sonder, eftersom sådana sonder ger en dosberoende vävnadsskada vid epidermala4 och sensoriska neuronala nivåer (Figur 2E). En andra eller efterföljande skadliga mekaniska stimulans, efter vävnad skador har inducerats, kan tänkas försämra funktionen hos de drabbade perifera sensoriska nervceller och framkalla en förändrad beteendemässiga svar. I en annan studie visade larver stimulerade två gånger med skadliga mekaniska sonder mestadels ett förbättrat beteendesvar5, vilket tyder på utveckling av en akut mekanisk sensibilisering (hyperalgesi), vilket kan bero på vävnadsskadan som provoceras av den första skadliga mekaniska stimulansen. Omvänt rapporterade andra författare6 ett blandat (ökat eller minskat) beteendesvar, vilket indikerar att det förändrade beteendesvaret kan bero på skador/dysfunktion i neuronalvävnaden. Stimulera varje larva endast en gång eliminerar möjliga varians i beteendemässiga svar som härrör antingen från sensibilisering eller vävnadsskador. För det fjärde stimulerade vi mekaniskt segment A8, som är mer bakre än tidigare studier (föredragna områden A3-A4)2,5,16. Sonder mellan ~3 900 kPa och 5 300 kPa som tillämpades på antingen segment A2 eller A8 visade inga beteendemässiga skillnader4. Dessutom är A8, jämfört med A2–A4, lättare att stimulera med mekaniska sonder som genererar lägre tryck (<300 kPa) eftersom larven är tunnare i denna region och därmed lättare komprimeras. Andra studier visade att skadlig mekanisk stimulering av larvens bakre ände (levererad av en styv insektsstift, som hålls med tång) mestadels framkallade framåtrörelse, snarare än ett aversivt eller rullandesvar 18. Detta olika beteendemässiga svar kan bero på skillnader i egenskaperna hos de använda materialen (böjbar nitinolglödtråd vs okomprimerbar insektsstift) eller på olika tryck som levereras till larverna (insektsstiftens tryckvärde rapporterades inte).
Utvecklingen av en mekanisk nociception-analys för Drosophila larver har gjort det möjligt för fältet att upptäcka att olika mekaniska sensoriska jonkanaler och neurala kretsar förmedlar mekanisk nociception5,6,16,17. Studien av den mekaniska överkänsligheten (allodyni och hyperalgesi) har dock släpat efter, jämfört med sensibilisering av andra sensoriska metoder – värme7,8,10,13,14, kall9och kemisk3. Denna fördröjning kan delvis bero på frånvaron av lämpliga mekaniska sonder som kan generera ett fullständigt responsområde som sträcker sig underredet till suprathresholdtryck. Av särskild betydelse, särskilt för att bedöma mekanisk allodyni, är subthreshold sonder som inte framkallar en aversiv rullande svar från oskadda larver. Betydelsen av våra förbättrade mekaniska sonder är att de kan tillverkas för att spänna över harmlösa stimuli (subthreshold ~174 kPa-200 kPa) eller det låga till höga skadliga intervallet (suprathreshold ~225 kPa till ~5,116 kPa). Här demonstrerar vi med hjälp av nitinol von Frey-liknande filament att Drosophila larver utvecklar både mekanisk allodyni och mekanisk hyperalgesi efter UV-bestrålning. Den mekaniska sensibiliseringen visar vissa skillnader jämfört med termisk sensibilisering. Både uppkomsten och toppen av mekanisk sensibilisering är tidigare (~ 4 h) jämfört med termisk (värme) sensibilisering (~ 8 h för hyperalgesi och ~ 24 h för allodynia)7. Dessutom är den mekaniska allodyni och hyperalgesi samtidiga (båda toppar på ~ 4 h). Dessutom, medan värmesensibilisering (allodyni och hyperalgesi) löser helt vid senaretidpunkter 7, uppvisade mekanisk överkänslighet en lång svans som förblev något över baslinjen. Kall sensibilisering i Drosophila innebär en förändring i kall-framkallade beteenden9 och uppkomsten av nya kall-framkallade beteenden – ett fenomen som inte observeras med mekanisk stimulering. Dessa skillnader i inset, varaktighet och observerade beteenden tyder på att varje sensorisk modalitet kan styras av olika signaleringsvägar. Att kombinera sensibiliseringsanalysen som beskrivs här med de kraftfulla genetiska verktyg som finns i Drosophila bör möjliggöra en exakt genetisk dissekering av den mekaniska överkänslighet (allodyni och hyperalgesi) observerad.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Thomas Wang för att ha utvecklat prototypen von Frey filaments, Patrick J. Huang för att förbättra den mekaniska sondanalysen, Bloomington Drosophila Stock Center för kontrollen (w1118) och ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP fluglager och Galko labmedlemmar för att kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av R21NS087360 och R35GM126929 till MJG.
Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |