تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة
Summary
في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة فقط عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC) في نظام ميكروفلويديك.
Abstract
تلعب المجالات الكهربائية الفسيولوجية (EF) أدوارا حيوية في هجرة الخلايا والتمايز والانقسام والموت. تصف هذه الورقة نظام زراعة الخلايا الدقيقة الذي تم استخدامه لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل باستخدام المجهر. يتكون النظام microfluidic من المكونات الرئيسية التالية: رقاقة كهربائية شفافة بصريا ، وسخان شفاف لأكسيد القصدير (ITO) ، ومضخة تعبئة وسائط الثقافة ، وإمدادات الطاقة الكهربائية ، ومكبر صوت عالي التردد ، ومضاعف EF ، ومرحلة آلية قابلة للبرمجة X-Y-Z ، ومجهر مقلوب على النقيض من الطور مجهز بكاميرا رقمية. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. يتضمن هذا العمل التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC). في المتوسط صيانة الخلايا الجذعية، وNPCs الماوس (mNPCs) تفرقت في الخلايا العصبية، والخلايا الفلكية، وoligodendrocytes بعد التحفيز نبض العاصمة. وتشير النتائج إلى أن العلاج البسيط لنبض DC يمكن أن يتحكم في مصير ال MNPCs ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية لاضطرابات الجهاز العصبي. يمكن استخدام النظام زراعة الخلايا في قنوات متعددة، لتحفيز EF على المدى الطويل، للمراقبة المورفولوجية الخلية، والحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني. هذا النظام microfluidic ليس فقط يقصر الوقت التجريبي المطلوب، ولكن أيضا يزيد من دقة السيطرة على البيئة الدقيقة.
Introduction
يمكن أن تكون الخلايا السليفة العصبية (NPCs ، المعروفة أيضا باسم الخلايا الجذعية العصبية والذرية) كمرشح واعد للاستراتيجية العلاجية العصبية1. الشخصيات غير المتمايزة لديها قدرة التجديد الذاتي، متعددة الفعالية، والقدرة على الانتشار2،3. وقد ذكرت دراسة سابقة أن المصفوفة خارج الخلية والوسطاء الجزيئية تنظيم التمايز من المجلس الوطني للصحافه. عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) تعزيز انتشار المجلس الوطني للصحافه، وبالتالي الحفاظ على الدولة غير المتمايزة4.
وقد ذكرت الدراسات السابقة أن التحفيز الكهربائي يمكن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية الخلية مثل القسم5، الهجرة6،7،8، التمايز1،9،10، وموت الخلية11. تلعب المجالات الكهربائية (EFs) أدوارا حيوية في تطوير وتجديد تطوير الجهاز العصبي المركزي12و13و14. من 2009 إلى 2019، قام هذا المختبر بالتحقيق في الاستجابات الخلوية لتطبيق EF في النظام الدقيق1، 6،7،8،15،16،17. تم تصميم رقاقة متعددة القنوات وشفافة بصريا والكهربائية (MOE) لتكون مناسبة لتلطيخ immunofluorescence للتنظير المجهري الكونف البؤري. كانت الشريحة ذات شفافية بصرية عالية ومتانة جيدة وسمحت بإجراء ثلاث تجارب تحفيز مستقلة في وقت واحد والعديد من الحالات الملطخة بالمناعة في دراسة واحدة. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. تصف هذه الورقة تطور نظام زراعة الخلايا الدقيقة التي استخدمت لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تصنيع رقاقة MOE ، يتم إرفاق المحولات بالطبقة 1 من رقاقة MOE مع غراء سيانواكريلات سريع المفعول. يتم تطبيق الغراء على 4 زوايا من المحولات، ومن ثم يتم تطبيق الضغط بالتساوي على محولات. يجب تجنب كمية زائدة من الغراء لضمان البلمرة كاملة من الغراء. وعلاوة على ذلك، يتم احتضان تجميع رقاقة MOE المكت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون البروفيسور تانغ ك. تانغ، معهد العلوم الطبية الحيوية، أكاديميا سينيكا، على مساعدته في توفير الخلايا الجذعية العصبية للفأر والخلايا السلف (mNPCs). كما يشكر المؤلفان البروفيسور تانغ ك. تانغ والسيدة ينغ شان لي على مناقشتيهما القيمة بشأن التمييز بين الشخصيات غير الوطنية.
Materials
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG – H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
