Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular
Summary
Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.
Abstract
O cerebelo desempenha um papel importante em várias funções-chave, incluindo controle de movimento, equilíbrio, cognição, recompensa e afeto. Estudos de imagem indicam que regiões cerebelares distintas contribuem para essas diferentes funções. Estudos moleculares que examinam as diferenças cerebelares regionais estão defasando, pois são feitos principalmente em extratos cerebelares inteiros, mascarando assim quaisquer distinções em regiões cerebelares específicas. Aqui descrevemos uma técnica para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida quatro regiões cerebelares diferentes: os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar vermal anterior e posterior, e o córtex cerebelar dos hemisférios. Dissecar essas regiões distintas permite a exploração de mecanismos moleculares que possam fundamentar suas contribuições únicas para o equilíbrio, o movimento, o afeto e a cognição. Esta técnica também pode ser usada para explorar diferenças na suscetibilidade patológica dessas regiões específicas em vários modelos de doenças de camundongos.
Introduction
O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro1. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto2,3,4,5.
O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grânulo e enviam entrada através de fibras paralelas aos dendritos celulares Purkinje da camada molecular que também recebem entrada de fibras de escalada que se originaram na azeitona inferior. As células purkinje enviam projeções inibitórias para as células nos núcleos cerebelares profundos (DCN), que serve como a principal saída do cerebelo. A saída deste circuito cerebelar é ainda mais modulada pela atividade dos interneurônios inibitórios no córtex cerebelar, incluindo Golgi, stellate e células cesta4. Esta unidade funcional cerebelar é distribuída por todos os lobules do córtex cerebelar. Apesar deste circuito relativamente uniforme em todo o cerebelo, evidências da literatura de neuroimagem humana e estudos de pacientes indicam heterogeneidade funcional do cerebelo6,7.
O córtex cerebelar pode ser dividido em duas regiões principais: os vermis definidos pela linha média e os hemisférios laterais. Os vermis podem ser ainda divididos em lobulos anteriores e posteriores. Essas regiões distintas do cerebelo foram implicadas em contribuir para diferentes comportamentos. Padrões de atividade evocados por tarefas ou sem tarefas implicaram que as regiões anteriores dos vermis contribuem mais para a função motora, enquanto vermis posteriores contribuem mais para a cognição6,7. Os vermis também estão ligados ao afeto e às emoções, enquanto os hemisférios cerebelares contribuem para funções executivas, visuais-espaciais, linguísticas e outras funções mnemônicas8. Além disso, estudos anatômicos forneceram evidências de que regiões cerebelares funcionalmente distintas estão conectadas com diferentes regiões corticais9. O mapeamento de lesões-sintomas revelou que pacientes com derrames que afetam os lobulos anteriores (estendendo-se ao lobule VI) apresentaram pior desempenho em tarefas motoras finas, enquanto pacientes com danos em regiões posteriores do lobo e hemisférios apresentaram déficits cognitivos na ausência da síndrome motor cerebelar10. Por fim, a patologia cerebelar regional em doença indica que as regiões cerebelares funcionalmente distintas também são diferentemente suscetíveis à doença11,12.
Embora muito menos exploradas, evidências preliminares demonstram distintas assinaturas de expressão genética em regiões corticais cerebelares. A expressão celular purkinje de Zebrin II mostra a padronização específica da região nos vermímis de tal forma que há mais células positivas zebrin II nos lobulos posteriores e menos nos lobulos anteriores13. Isso também se correlaciona com a função fisiológica regionalmente distinta, pois as células Purkinje negativas zebrin II apresentam maior frequência de disparo tônico do que as células Purkinje que são Zebrin II positiva14.
Além do córtex cerebelar, o cerebelo inclui os núcleos cerebelares profundos (DCN) que servem como a saída primária para o cerebelo. Os núcleos são compostos pelos núcleos medial (MN), interposto (IN) e núcleos laterais (LN). Imagens funcionais e estudos de pacientes demonstraram que o DCN também participa de vários comportamentos15, mas pouquíssimos estudos examinam a mudança da expressão genética no DCN.
Os avanços nas técnicas moleculares permitiram avaliar a expressão genética regional no cérebro e descobriram a heterogeneidade em diferentes regiões cerebrais nos estados fisiológicos e dedoenças 16. Tais estudos implicam que o cerebelo é diferente de outras regiões cerebrais. Por exemplo, a proporção de neurônios para células gliais é invertida no cerebelo em comparação com outras regiões cerebrais1. Mesmo em condições fisiológicas normais, a expressão de genes proinflamatórios é regulada no cerebelo em comparação com as outras regiões cerebrais17. Técnicas moleculares também têm sido muito úteis na identificação dos caminhos que contribuem para a patogênese das doenças cerebelares. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de todos os extratos cerebelares identificou genes alterados em um modelo de rato transgênico específico da célula Purkinje de ataxia spinocerebellar tipo 1 (SCA1) em comparação com seus controles de tipo selvagem. Tais evidências revelaram as principais vias moleculares subjacentes à patogênese nas células cerebelares Purkinje e ajudaram a identificar potenciais alvos terapêuticos18. No entanto, estudos recentes sugerem que há diferenças na vulnerabilidade às doenças nas regiões cerebelares11,12,19. Isso pode indicar que há mudanças-chave ocorrendo em regiões cerebelares distintas, que podem ser mascaradas ou não detectadas com extratos cerebelares inteiros. Assim, é necessário desenvolver técnicas que permitam aos pesquisadores examinar perfis moleculares em diferentes regiões cerebelares.
A técnica aqui proposta descreve um método reprodutível para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo, a fim de isolar o RNA dessas regiões e explorar diferenças regionais na expressão genética. O esquema do cerebelo do rato na Figura 1A destaca os vermísis em azul, e hemisférios em amarelo. Especificamente, esta técnica permite isolar quatro regiões: núcleos cerebelares profundos (DCN) (caixas pontilhadas vermelhas na Figura 1A), o córtex cerebelar de vermis anterior (CCaV) (azul escuro em Figura 1A), o córtex cerebelar dos vermis posteriores (CCpV) (azul claro na Figura 1A), e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH) (amarelo na Figura 1A). Ao avaliar a expressão genética dessas regiões separadamente, será possível investigar mecanismos moleculares subjacentes a funções discretas dessas diferentes regiões, bem como potenciais diferenças em sua vulnerabilidade na doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui permite avaliar a expressão genética subjacente e os mecanismos moleculares dentro de quatro regiões cerebelares distintas – os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar anterior dos vermis (CCaV), o córtex cerebelar posterior dos vermis (CCPV) e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH). A capacidade de avaliar essas regiões separadamente ampliará nosso conhecimento da heterogeneidade de regiões cerebelares específicas e possivelmente lançará luz sobre sua contribuiç…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa no laboratório de Cvetanovic por sua ajuda na solução de problemas e na extração de RNA e RTqPCR. Esta pesquisa é financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS Instituto Nacional de Saúde (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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