Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Résumé

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Résumé

Traditionnellement utilisés pour les essais biochimiques en vrac, les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont devenus un puissant outil basé sur l’imagerie pour étudier les phénomènes cytoplasmiques, tels que la cytokinèse, la formation de fuseau mitotique et l’assemblage du noyau. S’appuyant sur les premières méthodes qui ont imagé des extraits fixes échantillonnés à des points temporels clairsemés, les approches récentes imagent des extraits vivants en utilisant la microscopie accélérée, révélant des caractéristiques plus dynamiques avec une résolution temporelle améliorée. Ces méthodes nécessitent généralement des traitements de surface sophistiqués du vaisseau d’imagerie. Nous présentons ici une méthode alternative pour l’imagerie en direct d’extraits d’œufs qui ne nécessitent aucun traitement de surface chimique. Il est simple à mettre en œuvre et utilise des consommables de laboratoire produits en série pour l’imagerie. Nous décrivons un système qui peut être utilisé à la fois pour la microscopie à grand champ et la microscopie confocale. Il est conçu pour l’imagerie d’extraits dans un champ 2 dimensions (2D), mais peut être facilement étendu à l’imagerie en 3D. Il est bien adapté pour étudier la formation de motifs spatiaux dans le cytoplasme. Avec des données représentatives, nous démontrons l’organisation dynamique typique des microtubules, noyaux et mitochondries dans des extraits interphasiques préparés à l’aide de cette méthode. Ces données d’images peuvent fournir des informations quantitatives sur la dynamique cytoplasmique et l’organisation spatiale.

Introduction

Le cytoplasme constitue le volume principal d’une cellule et a une organisation distincte. Les ingrédients du cytoplasme eucaryote peuvent s’auto-assembler en un large éventail de structures spatiales, telles que les asters de microtubules et l’appareil de Golgi, qui à leur tour sont disposés dynamiquement et retournés en fonction de l’identité et de l’état physiologique de la cellule. Comprendre l’organisation spatiale du cytoplasme et son lien avec les fonctions cellulaires est donc important pour comprendre le fonctionnement de la cellule. Les extraits d’œufs de Xenopus laevis ont traditionnellement été utilisés pour des essais biochimiques en vrac

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Stanford.

1. Préparation des diapositives et des feuillets de couverture

1. Appliquez une couche de ruban adhésif d’éthylène propylène fluoré (FEP) sur une lame de verre à l’aide d’un applicateur à rouleaux. Coupez le ruban adhésif excessif sur les bords avec une lame de rasoir propre. Préparez les feuillets de couverture recouverts de ruban FEP de la même manière (Figure 1A).
2. Appliquez une entretoise d’imagerie collante double face sur le côté de la lame recouvert de....

Résultats

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis peuvent être utilisés pour étudier l’auto-organisation du cytoplasme pendant l’interphase. La figure 2A montre les résultats d’une expérience réussie. Nous avons complété des extraits arrêtés par interphase avec des noyaux de spermatozoïdes¹⁹ de Xenopus laevis à une concentration de 27 noyaux/μL et 0,38 μM de GST-GFP-NLS 27,28,29,30 purifiés (protéine de fusion composée de glutath.......

Discussion

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont apparus comme un puissant système modèle pour les études basées sur l’imagerie de diverses structures subcellulaires 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 et l’organisation cytoplasmique dans son ensemble.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger de 17 ml	Beckman Coulter	337986
22x22 mm carré #1 verre de couverture	Corning	284522
Aprotinine	MilliporeSigma	10236624001	Inhibiteur de protéase
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Inhibiteur de synthèse des protéines
Cytochalasine B	MilliporeSigma	C6762	Actine Inhibiteur de polymérisation
Grenouilles femelles Xenopus laevis Nasco		LM00535MX
Protéine de tubuline fluorescente HiLyte 488	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	Pour visualiser le cytosquelette des microtubules Cytoskeleton
Cytoskeleton (Cytoskeleton, Inc.		TL670M-A	Pour visualiser le cytosquelette des microtubules
Ruban optiquement transparent d’éthylène-propylène fluoré (FEP)	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Pipette Pasteur en verre	Fisher Scientific	13-678-20C
Gonadotrophine chorionique humaine (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Espaceur d’imagerie	Microscopie électronique Sciences	70327-8S
Leupeptine	MilliporeSigma	11017101001	Inhibiteur de protéase
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-518-100B
Huile minérale	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	Pour visualiser les mitochondries
Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Applicateur à rouleau	Amazon	B07HMBJSP8	Pour appliquer le ruban FEP sur les lames de verre et les lamelles
Lames de rasoir à simple tranchant	Fisher Scientific	12-640	Pour enlever l’excès de ruban FEP
Pipette de transfert	Fisher Scientific	13-711-7M