Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires
Summary
Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.
Abstract
L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.
Introduction
L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladiescardiovasculaires 1. Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,3. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. De nombreuses études ont étudié le rôle des ARN codant pour les protéines dans la physiologie des adipocytes et leur association avec l’obésité.
Plus récemment, la découverte d’ARN non codants (ARNnc), en particulier de micro-ARN (miR), a forgé de nouveaux concepts liés au mécanisme de régulation des programmes d’expression génique. Des études ont montré que les ARNnc sont d’importants régulateurs de la fonction adipocytaire, et que leur dérèglement joue un rôle important dans les maladies métaboliques4. Ainsi, la manipulation des protéines et des ARNnc dans les adipocytes est cruciale pour déchiffrer leurs rôles dans la fonction adipocytaire et leur impact sur des pathologies telles que le DT2. Cependant, la manipulation de l’expression des protéines et des ARNnc in vivo ainsi que dans les adipocytes primaires reste très difficile, favorisant l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro.
Les fibroblastes murins 3T3-L1 se différencient facilement en adipocytes matures, fonctionnels et sensibles à l’insuline, qui sont une lignée cellulaire bien caractérisée utilisée pour étudier la fonction adipocytaire (par exemple, la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipolyse et la sécrétion d’adipokines)5,6,7,8,9,10. Ces propriétés font des adipocytes 3T3-L1 un modèle attrayant pour moduler l’expression des protéines codant et des ARN nc afin de déchiffrer leur rôle dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité. Malheureusement, alors que les fibroblastes 3T3-L1 sont faciles à transfecter à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, les adipocytes 3T3-L1 différenciés sont l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. C’est pourquoi de nombreuses études manipulant l’expression des gènes dans les cellules 3T3-L1 se sont concentrées sur la différenciation des adipocytaires plutôt que sur la fonction adipocytaire.
Pendant longtemps, la seule technique efficace pour transfecter les adipocytes était l’électroporation5, qui est fastidieuse, coûteuse et peut causer des dommages cellulaires. Cet article rapporte une technique de transfection inverse utilisant un réactif de transfection commun, qui réduit le temps de transfection pratique, n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire et est beaucoup moins coûteuse que l’électroporation. Ce protocole est parfaitement adapté à la transfection de siRNA et d’autres oligonucléotides tels que les mimiques de micro-ARN (miR mimics) et les anti-miR. Le principe du protocole de transfection inverse est d’incuber le réactif de transfection et les oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire, puis d’ensemencer les adipocytes matures dans les puits. Ensuite, les adipocytes se rattachent à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Cette méthodologie simple, efficace et peu coûteuse permet d’étudier le rôle des ARN et des miR codant pour les protéines dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’INSERM, l’Université Côte d’Azur et l’Agence nationale de la recherche (ANR) Français à travers les programmes Investissements pour le futur Laboratoire d’Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) et Initiative d’Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. est soutenu par des subventions de la Société Francophone du Diabète (SFD), de l’Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), de l’Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) et de la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. est pris en charge par ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. est soutenu par la bourse ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 et une subvention de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Nous remercions également le Centre Central d’Imagerie du C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, qui est également soutenu par la Plateforme de Microscopie et d’Imagerie GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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