アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射
Summary
昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。
Abstract
社会的行動や生殖分業などの真社会性昆虫のユニークな形質は、その遺伝子システムによって制御されています。遺伝子が社会的形質をどのように制御するかを調べるために、私たちはCRISPR複合体を若い胚の合胞期に送達することを介して変異アリを開発しました。ここでは、顕著な表現型の可塑性を示すポネリンアリ種である ハルペグナトスソルテーターにおけるCRISPRを介した突然変異誘発のプロトコルを提供します。 H.ソルテーター アリは実験室環境で容易に飼育されます。胚は、Cas9タンパク質によるマイクロインジェクションのために収集され、自家製の石英針を使用して in vitro で合成された低分子ガイドRNA(sgRNA)です。注射後の胚はコロニーの外で飼育されます。最初の幼虫の出現後、すべての胚と幼虫は、さらなる発達のために数人の看護労働者と一緒に巣箱に運ばれます。このプロトコルは、アリのカースト特異的な生理学や社会的行動の分析のための突然変異誘発を誘発するのに適していますが、膜翅目や他の昆虫のより広いスペクトルにも適用できます。
Introduction
昆虫の真社会性の進化、すなわち膜翅目とブラットデア目(旧等翅目)の進化は、個体レベルとコロニーレベルの両方で現れる独特でしばしば洗練された行動形質をもたらしました。社会性昆虫の最も進んだグループを特徴付ける特性である生殖分業には、多くの場合、いくつかの行動的およびしばしば形態学的に特徴的なグループで構成されるカーストシステムが含まれます。カースト間のこのような行動的および形態学的多様性は、その遺伝システムだけでなく、しばしば環境によっても制御されており1,2,3,4、真社会性昆虫を遺伝的およびエピジェネティックな研究にとって魅力的な対象にしています。
真社会性昆虫の遺伝システムを操作する能力は、多くの種が実験室の設定で交尾および繁殖しないため、困難であることが証明されています。ほとんどの真社会性昆虫はまた、コロニー内に生殖個体が非常に少ないため、生産できる子孫の数が制限され、その結果、遺伝子操作のサンプルサイズが制限されます5。さらに、多くの真社会性昆虫は、遺伝学的研究に一般的に使用される昆虫( ショウジョウバエなど)と比較して発生時間が長く、遺伝子系統を確立することが困難になっています5。しかし、一部の真社会性種は、コロニー内で生殖活動的な個体の大部分を生成する可能性があり、これにより課題が軽減され、突然変異株またはトランスジェニック系統を確立する機会が提供されます。
ポネリンアリ種であるハルペグナトスソルテーターの場合、すべての女性労働者は、女王の死または社会的孤立時に生殖活動的になる可能性があります。これらのワーカーは「ゲーマーゲート」と呼ばれ、新しいコロニー6を生成するために使用できます。さらに、コロニー内に複数のゲーマーゲートが存在する可能性があり、したがって子孫の生産が増加する5、7、8。これまでに、ヨーロッパミツバチのApis mellifera、およびアリの種であるH. saltator、Ooceraea biroi、およびSolenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15で変異株および/またはトランスジェニック系統が開発されています。.社会性ミツバチとアリの遺伝子分析は、真社会性のより良い理解への道を開き、遺伝子とそれらが真社会性昆虫の行動とカースト固有の生理学に与える影響を研究する一連の機会を提供しました。
ここでは、H.ソルテーターのCRISPR/Cas9システムを介した遺伝子組み換えのプロトコルを提供します。具体的には、この手法を使用して、すべての匂い受容体(OR)の絶対補助受容体をコードする遺伝子であるorcoに生殖細胞系列変異を生成しました10。膜翅目の真社会性昆虫ではOR遺伝子が著しく拡大しており16、オルコは昆虫の嗅覚に不可欠な役割を果たしています。それがない場合、ORは正常に組み立てられないか機能しません。したがって、オルコ遺伝子の突然変異は、嗅覚、神経発達、および関連する社会的行動を混乱させます9,10。
このプロトコルでは、Cas9タンパク質と低分子ガイドRNA(sgRNA)を、標的遺伝子の突然変異誘発を誘導する目的で、マイクロインジェクションを使用してアリ胚に導入します。ここでは、コロニーや注入された胚のケアに関する指示とともに、マイクロインジェクションの手順について詳しく説明します。これらの方法は、 H. saltator アリの様々な異なる遺伝子における突然変異誘発を誘導するのに適切であり、より広いスペクトルの膜翅目昆虫に適用され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
アリ、ハチ、ハチ、シロアリなどの昆虫の真社会性の進化は、新しい行動的および形態学的形質の出現をもたらし、その多くは環境的および遺伝的要因の組み合わせによって影響を受けると理解されています1,2,3,4。残念ながら、遺伝学の分野における研究モデルとしての真社会性昆虫の魅力と有…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、アリの遺伝学に関する支援について、ニューヨーク大学のダニー・ラインバーグとクロード・デスプランの研究室、アリゾナ州立大学のユルゲン・リービッヒの研究室に感謝している。Hua Yanは、国立科学財団I / UCRC、助成金番号IIP-1821914に基づく節足動物管理技術センター、および業界パートナーからの支援を認めています。マヤサールは、米国-イスラエル二国間農業研究開発基金、Vaadia-BARDポスドクフェローシップ番号FI-595-19の支援を受けました。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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