Embryoinjeksjoner for CRISPR-mediert mutagenese i Ant Harpegnathos saltator
Summary
Mange kjennetegn ved insekt eusosialitet stole på innen-kolonien kommunikasjon og arbeidsdeling. Genetisk manipulering av viktige regulatoriske gener i maurembryoer via mikroinjeksjon og CRISPR-mediert mutagenese gir innsikt i arten av altruistisk oppførsel hos eusosiale insekter.
Abstract
De unike egenskapene til eusosiale insekter, som sosial atferd og reproduktiv arbeidsdeling, styres av deres genetiske system. For å adressere hvordan gener regulerer sosiale egenskaper, har vi utviklet mutante maur via levering av CRISPR-kompleks til unge embryoer i løpet av deres syncytiale stadium. Her gir vi en protokoll av CRISPR-mediert mutagenese i Harpegnathos saltator, en ponerinmyrart som viser slående fenotypisk plastisitet. H. saltatormyrer er lett oppdrettet i laboratorieinnstilling. Embryoer samles inn for mikroinjeksjon med Cas9-proteiner og in vitro syntetiserte små guide-RNA (sgRNA) ved bruk av hjemmelagde kvartsnåler. Embryoer etter injeksjon oppdrettes utenfor kolonien. Etter fremveksten av den første larven blir alle embryoer og larver transportert til en reirkasse med noen få pleiearbeidere for videre utvikling. Denne protokollen er egnet for å indusere mutagenese for analyse av kastespesifikk fysiologi og sosial atferd hos maur, men kan også brukes på et bredere spekter av hymenopteraner og andre insekter.
Introduction
Utviklingen av eusosialitet hos insekter, nemlig de av ordrene Hymenoptera og Blattodea (tidligere Isoptera), har resultert i unike og ofte sofistikerte atferdstrekk som manifesterer seg på både individ- og koloninivå. Reproduktiv arbeidsdeling, et trekk som karakteriserer de mest avanserte gruppene av sosiale insekter, involverer ofte kastesystemer sammensatt av flere atferdsmessig og ofte morfologisk særegne grupper. Slike atferdsmessige og morfologiske mangfold mellom kaster styres ikke bare av deres genetiske system, men også ofte av miljøet 1,2,3,4, noe som gjør eusosiale insekter attraktive for genetisk og epigenetisk forskning.
Evnen til å manipulere det genetiske systemet av eusosiale insekter har vist seg å være utfordrende, da mange arter ikke parrer seg og reproduserer i laboratorieinnstillinger. De fleste eusosiale insekter har også svært få reproduktive individer i en koloni, noe som begrenser antall avkom som kan produseres og dermed begrenser prøvestørrelsen for genetisk manipulasjon5. I tillegg har mange eusosiale insekter lange generasjonstider sammenlignet med insekter som vanligvis brukes til genetiske studier (som Drosophila), og legger til vanskeligheten med å etablere genetiske linjer5. Noen eusosiale arter kan imidlertid generere en stor andel reproduktivt aktive individer i en koloni, noe som lindrer utfordringene og gir muligheter til å etablere mutante eller transgene linjer.
Når det gjelder ponerine-maurarten, Harpegnathos saltator, kan alle kvinnelige arbeidere bli reproduktivt aktive ved dronningens død eller sosial isolasjon. Disse arbeiderne blir referert til som “gamergates” og kan brukes til å generere nye kolonier6. Videre kan det være mer enn en gamergate til stede i en koloni, og dermed øke avkomproduksjonen 5,7,8. Så langt har mutante og / eller transgene linjer blitt utviklet i den europeiske honningbien, Apis mellifera, og i maurarten, H. saltator, Ooceraea biroi og Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiske analyser i sosiale bier og maur har banet vei mot en bedre forståelse av eusosialitet, og gir en rekke muligheter til å studere gener og deres innvirkning på eusosial insektadferd og kastespesifikk fysiologi.
Her gir vi en protokoll for genmodifisering via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Spesielt ble denne teknikken brukt til å generere en kimlinjemutasjon i orco, genet som koder for den obligatoriske koreseptoren til alle odorantreseptorer (ORs)10. OR-gener har blitt bemerkelsesverdig utvidet i hymenopteran eusosiale insekter16, og orco spiller en viktig rolle i insektolfaction; i fravær monteres eller fungerer ikke ORs normalt. Mutasjoner av orco-genet forstyrrer derfor olfaktorisk sensasjon, nevral utvikling og tilhørende sosial atferd 9,10.
I denne protokollen blir Cas9-proteiner og små guide-RNA (sgRNA) introdusert i myrembryoer ved hjelp av mikroinjeksjon med det formål å indusere mutagenese av et målgen. Her vil vi beskrive mikroinjeksjonsprosedyren i detalj sammen med instruksjoner om omsorg for kolonier og injiserte embryoer. Disse metodene er egnet for å indusere mutagenese i en rekke forskjellige gener i H. saltatormyrer og kan brukes på et bredere spekter av hymenopteran insekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av eusosialitet blant insekter, inkludert maur, bier, veps og termitter, har resultert i utseendet på nye atferdsmessige og morfologiske egenskaper, hvorav mange forstås å være påvirket av en kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer 1,2,3,4. Dessverre har attraktiviteten og nytten av eusosiale insekter som forskningsmodeller innen genetikk blitt hindret av vanskelighe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Danny Reinbergs og Claude Desplans laboratorier ved New York University og Jürgen Liebigs laboratorium ved Arizona State University for deres støtte til maurgenetikk. Hua Yan anerkjenner støtte fra National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under Grant No. IIP-1821914 og av industripartnere. Maya Saar ble støttet av USA – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
