מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.
Abstract
המוח הוא מרכז הפיקוד של מערכת העצבים של היונקים ואיבר בעל מורכבות מבנית עצומה. המוח, המוגן בתוך הגולגולת, מורכב מכיסוי חיצוני של חומר אפור מעל ההמיספרות הידועות בשם קליפת המוח. מתחת לשכבה זו שוכנים מבנים מיוחדים רבים אחרים החיוניים לריבוי תופעות החשובות לקיום. רכישת דגימות של אזורים ספציפיים במוח ברוטו דורשת שלבי דיסקציה מהירים ומדויקים. מובן כי ברמה המיקרוסקופית, קיימים תתי-אזורים רבים וסביר להניח שהם חוצים את הגבולות האזוריים השרירותיים שאנו כופים לצורך ניתוח זה.
מודלים של עכברים משמשים באופן שגרתי לחקר תפקודי מוח אנושיים ומחלות. שינויים בדפוסי ביטוי הגנים עשויים להיות מוגבלים לאזורי מוח ספציפיים המכוונים לפנוטיפ מסוים בהתאם למצב החולה. לפיכך, יש חשיבות רבה ללמוד את הרגולציה של תמלול ביחס לארגון המבני המוגדר היטב שלה. הבנה מלאה של המוח דורשת לחקור אזורים מובחנים במוח, להגדיר קשרים ולזהות הבדלים מרכזיים בפעילות של כל אחד מאזורי המוח האלה. הבנה מקיפה יותר של כל אחד מהאזורים הנפרדים הללו עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים ומשופרים בתחום מדעי המוח. במאמר זה נדון במתודולוגיה שלב אחר שלב לניתוח מוח העכבר ל-16 אזורים נפרדים. בהליך זה, התמקדנו בהסרת מוח של עכבר זכר C57Bl/6J (בן 6-8 שבועות) וניתוחו לאזורים מרובים באמצעות ציוני דרך נוירו-אנטומיים כדי לזהות ולדגום אזורי מוח נפרדים הרלוונטיים מבחינה תפקודית ורלוונטיים להתנהגות. עבודה זו תסייע להניח בסיס חזק בתחום מדעי המוח, ותוביל לגישות ממוקדות יותר בהבנה עמוקה יותר של תפקוד המוח.
Introduction
המוח, יחד עם חוט השדרה והרשתית, מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית המבצעת התנהגויות מורכבות, הנשלטות על ידי סוגי תאים מיוחדים, ממוקמים במדויק ומתקשרים בכל הגוף1. המוח הוא איבר מורכב עם מיליארדי נוירונים מחוברים וגליה עם מעגלים מדויקים המבצעים פונקציות רבות. זהו מבנה דו-צדדי בעל שתי אונות נפרדות ומרכיבים תאיים מגוונים2. חוט השדרה מחבר את המוח לעולם החיצון ומוגן על ידי עצמות, קרום המוח והנוזל השדרתי ומנתב מסרים אל המוחוממנו 2,3,4. פני השטח של המוח, קליפת המוח, אינם אחידים ויש להם קפלים נפרדים, הנקראים gyri, וחריצים, הנקראים sulci, המפרידים את המוח למרכזים פונקציונליים5. קליפת המוח חלקה ביונקים עם מוח קטן 6,7. חשוב לאפיין וללמוד את הארכיטקטורה של המוח האנושי על מנת להבין את ההפרעות הקשורות לאזורי המוח השונים, כמו גם את המעגלים התפקודיים שלו. המחקר במדעי המוח התרחב בשנים האחרונות ומגוון שיטות ניסיוניות משמשות לחקר המבנה והתפקוד של המוח. התפתחויות בתחומי הביולוגיה המולקולרית והמערכותית הובילו לעידן חדש של חקר היחסים המורכבים בין מבנים מוחיים לתפקוד מולקולות. בנוסף, ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה ואפיגנטיקה מתרחבות במהירות, ומאפשרות לנו לקדם את הידע שלנו על המנגנונים הבסיסיים המעורבים באופן שבו מערכות מתפקדות. ניתוחים אלה יכולים להתבצע על בסיס מקומי הרבה יותר, כדי לעזור למקד את החקירה והפיתוח של טיפולים יעילים יותר.
מוח היונקים מוגדר מבחינה מבנית לאזורים בדידים הניתנים לזיהוי ברור; עם זאת, המורכבות הפונקציונלית והמולקולרית של מבנים בדידים אלה עדיין אינה מובנת בבירור. האופי הרב-ממדי והרב-שכבתי של רקמת המוח מקשה על חקר הנוף הזה ברמה התפקודית. בנוסף, העובדה כי פונקציות מרובות מבוצעות על ידי אותו מבנה ולהיפך מסבך עוד יותר את ההבנה של המוח8. חיוני שהגישה הניסויית המבוצעת לאפיון מבני ותפקודי של אזורי מוח תשתמש במתודולוגיות מחקר מדויקות כדי להשיג עקביות בדגימה לצורך קורלציה בין ארכיטקטורה נוירו-אנטומית לתפקוד. המורכבות של המוח הוסברה לאחרונה באמצעות ריצוף שלתא בודד 9,10 כגון הפיתול הטמפורלי של המוח האנושי המורכב מ-75 סוגי תאים שונים 11. על ידי השוואת נתונים אלה לאלה מאזור מקביל במוח העכבר, המחקר לא רק חושף קווי דמיון בארכיטקטורה ובסוגי התאים שלהם, אלא גם מציג את ההבדלים. כדי לפענח את המנגנונים המורכבים, חשוב אפוא לחקור אזורים שונים במוח בדיוק מלא. מבנים ותפקוד משומרים בין מוח אדם לעכבר מאפשרים שימוש בעכבר כפונדקאית ראשונית להבהרת תפקוד המוח האנושי ותוצאות התנהגותיות.
עם התקדמות הגישות של ביולוגיה מערכתית, קבלת מידע מאזורי מוח בדידים במכרסמים הפכה להליך מרכזי בחקר מדעי המוח. בעוד שפרוטוקולים מסוימים כגון מיקרודיסקציה ללכידת לייזר12 יכולים להיות יקרים, פרוטוקולים מכניים הם זולים ומבוצעים באמצעות כלים נפוצים13,14. השתמשנו באזורי מוח מרובים עבור מבחני תעתיק15 ופיתחנו הליך מעשי ומהיר לניתוח אזורי מוח של עכברים בעלי עניין באופן שלב אחר שלב תוך זמן קצר. לאחר הניתוח, דגימות אלה ניתן לאחסן מיד בתנאים קרים כדי לשמר את חומצות הגרעין והחלבונים של רקמות אלה. הגישה שלנו יכולה להתבצע מהר יותר מה שמוביל ליעילות גבוהה ומאפשר פחות סיכויים להידרדרות רקמות. זה בסופו של דבר, מגדיל את הסיכויים של יצירת ניסויים באיכות גבוהה, לשכפל באמצעות רקמות המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוח היונקים הוא איבר מורכב המורכב ממערך של תאים נבדלים מבחינה מורפולוגית וייחודיים מבחינה תפקודית עם חתימות מולקולריות מגוונות ואזורים מרובים המבצעים פונקציות מיוחדות ובדידות. להליך הנתיחה המדווח כאן יכולות להיות מספר מטרות בהתאם לדרישות המעבדה. במעבדה שלנו הערכנו שעתוק באזורי מוח מרו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגב’ סשמאליני סריניוואסן, למר סטיבן באטלר ולגב’ פמלה ספלמן על הסיוע הניסיוני ולגב’ דנה יוסף על עריכת כתב היד. התמיכה במימון של USAMRDC היא אסירת תודה. קרן ז’נבה תרמה לעבודה זו ונתמכה על ידי כספים ממנהל אזור המחקר הצבאי והתפעולי III באמצעות משרד המחקר של צבא ארה”ב.
כתב ויתור:
החומר נבדק על ידי מכון המחקר הצבאי על שם וולטר ריד. אין התנגדות להצגתו ו/או לפרסומו. הדעות או הקביעות הכלולות במסמך זה הן דעותיו הפרטיות של המחבר, ואין לפרשן כרשמיות, או כמשקפות דעות אמיתיות של מחלקת הצבא או משרד ההגנה. המחקר נערך תחת פרוטוקול מאושר לשימוש בבעלי חיים במתקן מוכר של AAALAC בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים ולחוקים ותקנות פדרליים אחרים הנוגעים לבעלי חיים ולניסויים המערבים בעלי חיים ומצייתים לעקרונות המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, הוצאת NRC, מהדורת 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
- P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).
