التشريح المجهري لدماغ الفأر إلى مناطق مختلفة وظيفيا وتشريحيا
Summary
نحن نقدم بروتوكولا عمليا وسريعا خطوة بخطوة لإزالة دماغ الفأر وتشريح المناطق المنفصلة من أنسجة المخ الطازجة. أصبح الحصول على مناطق الدماغ للتحليل الجزيئي أمرا روتينيا في العديد من مختبرات علم الأعصاب. يتم تجميد مناطق الدماغ هذه على الفور للحصول على بيانات نسخ عالية الجودة لتحليل مستوى النظام.
Abstract
الدماغ هو مركز القيادة للجهاز العصبي للثدييات وعضو ذو تعقيد هيكلي هائل. يتكون الدماغ المحمي داخل الجمجمة من غطاء خارجي للمادة الرمادية فوق نصفي الكرة الأرضية المعروفين باسم القشرة الدماغية. تحت هذه الطبقة توجد العديد من الهياكل المتخصصة الأخرى التي تعتبر ضرورية لظواهر متعددة مهمة للوجود. يتطلب الحصول على عينات من مناطق دماغية إجمالية محددة خطوات تشريح سريعة ودقيقة. ومن المفهوم أنه على المستوى المجهري، توجد العديد من المناطق دون الإقليمية ومن المحتمل أن تعبر الحدود الإقليمية التعسفية التي نفرضها لغرض هذا التشريح.
تستخدم نماذج الفئران بشكل روتيني لدراسة وظائف الدماغ البشري والأمراض. قد تقتصر التغيرات في أنماط التعبير الجيني على مناطق معينة في الدماغ تستهدف نمطا ظاهريا معينا اعتمادا على الحالة المريضة. وبالتالي ، من الأهمية بمكان دراسة تنظيم النسخ فيما يتعلق بتنظيمه الهيكلي المحدد جيدا. يتطلب الفهم الكامل للدماغ دراسة مناطق الدماغ المتميزة ، وتحديد الروابط ، وتحديد الاختلافات الرئيسية في أنشطة كل منطقة من مناطق الدماغ هذه. قد يمهد الفهم الأكثر شمولا لكل من هذه المناطق المتميزة الطريق لعلاجات جديدة ومحسنة في مجال علم الأعصاب. هنا ، نناقش منهجية خطوة بخطوة لتشريح دماغ الفأر إلى ستة عشر منطقة متميزة. في هذا الإجراء ، ركزنا على إزالة دماغ الفأر الذكر C57Bl / 6J (عمره 6-8 أسابيع) وتشريحه إلى مناطق متعددة باستخدام المعالم التشريحية العصبية لتحديد وأخذ عينات من مناطق الدماغ المنفصلة ذات الصلة وظيفيا والسلوكية. سيساعد هذا العمل في وضع أساس قوي في مجال علم الأعصاب ، مما يؤدي إلى نهج أكثر تركيزا في فهم أعمق لوظائف الدماغ.
Introduction
يتكون الدماغ ، إلى جانب الحبل الشوكي والشبكية ، من الجهاز العصبي المركزي الذي ينفذ السلوكيات المعقدة ، التي تسيطر عليها أنواع الخلايا المتخصصة والدقيقة والمتفاعلة في جميع أنحاء الجسم بأكمله1. الدماغ هو عضو معقد مع مليارات الخلايا العصبية المترابطة والخلايا الدبقية مع دوائر دقيقة تؤدي العديد من الوظائف. وهو هيكل ثنائي مع اثنين من الفصوص المتميزة والمكونات الخلوية المتنوعة2. يربط الحبل الشوكي الدماغ بالعالم الخارجي وهو محمي بالعظام والسحايا والسائل الدماغي الشوكي ويوجه الرسائل من وإلى الدماغ2،3،4. سطح الدماغ ، القشرة الدماغية ، غير متساو وله طيات مميزة ، تسمى gyri ، وأخاديد ، تسمى sulci ، التي تفصل الدماغ إلى مراكز وظيفية5. القشرة ناعمة في الثدييات ذات دماغ صغير 6,7. من المهم توصيف ودراسة بنية الدماغ البشري من أجل فهم الاضطرابات المتعلقة بمناطق الدماغ المختلفة ، وكذلك دوائره الوظيفية. توسعت أبحاث علم الأعصاب في السنوات الأخيرة ويتم استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية لدراسة بنية الدماغ ووظيفته. أدت التطورات في مجالات البيولوجيا الجزيئية وعلى مستوى الأنظمة إلى عصر جديد من استكشاف العلاقة المعقدة بين هياكل الدماغ وعمل الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة وعلم الوراثة اللاجينية تتوسع بسرعة ، مما يمكننا من تطوير معرفتنا بالآليات الأساسية المشاركة في كيفية عمل الأنظمة. يمكن إجراء هذه التحليلات على أساس أكثر محلية ، للمساعدة في استهداف التحقيق وتطوير علاجات أكثر فعالية.
يتم تعريف دماغ الثدييات هيكليا في مناطق منفصلة يمكن تحديدها بوضوح. ومع ذلك ، فإن التعقيدات الوظيفية والجزيئية لهذه الهياكل المنفصلة ليست مفهومة بوضوح بعد. إن الطبيعة متعددة الأبعاد والمتعددة الطبقات لأنسجة المخ تجعل من الصعب دراسة هذا المشهد على المستوى الوظيفي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقيقة أن وظائف متعددة يتم تنفيذها بواسطة نفس الهيكل والعكس بالعكس يزيد من تعقيد فهم الدماغ8. من الأهمية بمكان أن يستخدم النهج التجريبي الذي تم تنفيذه للتوصيف الهيكلي والوظيفي لمناطق الدماغ منهجيات بحث دقيقة لتحقيق الاتساق في أخذ العينات لربط البنية التشريحية العصبية بالوظيفة. تم شرح تعقيد الدماغ مؤخرا باستخدام تسلسل الخلية الواحدة 9,10 مثل التلفيف الصدغي للدماغ البشري الذي يتكون من 75 نوعا متميزا من الخلايا 11. من خلال مقارنة هذه البيانات بتلك الموجودة في منطقة مماثلة من دماغ الفأر ، لا تكشف الدراسة عن أوجه التشابه في بنيتها وأنواع خلاياها فحسب ، بل تعرض أيضا الاختلافات. لكشف الآليات المعقدة ، من المهم دراسة مناطق متنوعة من الدماغ بدقة كاملة. الهياكل والوظائف المحفوظة بين دماغ الإنسان والفأر تمكن من استخدام الفأر كبديل أولي لتوضيح وظيفة الدماغ البشري والنتائج السلوكية.
مع تقدم نهج بيولوجيا النظم ، أصبح الحصول على المعلومات من مناطق الدماغ المنفصلة في القوارض إجراء رئيسيا في أبحاث علم الأعصاب. في حين أن بعض البروتوكولات مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر12 يمكن أن تكون باهظة الثمن ، فإن البروتوكولات الميكانيكية غير مكلفة ويتم تنفيذها باستخدام الأدوات المتاحة بشكل شائع13,14. لقد استخدمنا مناطق دماغية متعددة للمقايسات النسخية15 وطورنا إجراء عمليا وسريعا لتشريح مناطق دماغ الفئران ذات الأهمية بطريقة خطوة بخطوة في وقت قصير. بمجرد تشريحها ، يمكن تخزين هذه العينات على الفور في ظروف باردة للحفاظ على الأحماض النووية والبروتينات في هذه الأنسجة. يمكن تنفيذ نهجنا بشكل أسرع مما يؤدي إلى كفاءة عالية ويسمح بفرص أقل لتدهور الأنسجة. هذا في نهاية المطاف ، يزيد من فرص توليد تجارب عالية الجودة وقابلة للتكرار باستخدام أنسجة المخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
دماغ الثدييات هو عضو معقد يتكون من مجموعة من الخلايا المتميزة مورفولوجيا والفريدة وظيفيا مع توقيعات جزيئية متنوعة ومناطق متعددة تؤدي وظائف متخصصة ومنفصلة. يمكن أن يكون لإجراء التشريح المبلغ عنه هنا أهداف متعددة اعتمادا على متطلبات المختبر. في مختبرنا ، قمنا بتقييم النسخ في مناطق دماغية ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة سيشماليني سرينيفاسان والسيد ستيفن بتلر والسيدة باميلا سبيلمان على المساعدة التجريبية والسيدة دانا يوسف على تحرير المخطوطة. يتم الاعتراف بالدعم التمويلي من USAMRDC بامتنان. ساهمت مؤسسة جنيف في هذا العمل وتم دعمها بأموال من مديرية منطقة أبحاث الطب العسكري والتشغيلي الثالثة عبر مكتب أبحاث الجيش الأمريكي.
اخلاء المسؤوليه:
تمت مراجعة المواد من قبل معهد والتر ريد العسكري للبحوث. ولا يوجد اعتراض على عرضه و/أو نشره. الآراء أو التأكيدات الواردة هنا هي وجهات نظر خاصة للمؤلف ، ولا ينبغي تفسيرها على أنها رسمية ، أو على أنها تعكس وجهات نظر حقيقية لوزارة الجيش أو وزارة الدفاع. تم إجراء البحوث بموجب بروتوكول معتمد لاستخدام الحيوانات في منشأة معتمدة من AAALAC وفقا لقانون رعاية الحيوان والقوانين واللوائح الفيدرالية الأخرى المتعلقة بالحيوانات والتجارب التي تشمل الحيوانات وتلتزم بالمبادئ المنصوص عليها في دليل رعاية واستخدام المختبر ، منشور NRC ، طبعة 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
- P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).
