Vi præsenterer en praktisk, trin-for-trin, hurtig protokol til fjernelse af musehjerne og dissektion af diskrete områder fra frisk hjernevæv. At opnå hjerneområder til molekylær analyse er blevet rutine i mange neurovidenskabslaboratorier. Disse hjerneområder fryses straks for at opnå transkriptomiske data af høj kvalitet til analyse på systemniveau.
Hjernen er kommandocentral for pattedyrs nervesystem og et organ med enorm strukturel kompleksitet. Beskyttet i kraniet består hjernen af et ydre dække af gråt stof over halvkuglerne kendt som hjernebarken. Under dette lag ligger mange andre specialiserede strukturer, der er afgørende for flere fænomener, der er vigtige for eksistensen. Erhvervelse af prøver af specifikke grove hjerneområder kræver hurtige og præcise dissektionstrin. Det er underforstået, at der på mikroskopisk niveau findes mange underregioner og sandsynligvis krydser de vilkårlige regionale grænser, som vi pålægger med henblik på denne dissektion.
Musemodeller bruges rutinemæssigt til at studere menneskelige hjernefunktioner og sygdomme. Ændringer i genekspressionsmønstre kan begrænses til specifikke hjerneområder rettet mod en bestemt fænotype afhængigt af den syge tilstand. Det er således af stor betydning at studere regulering af transkription med hensyn til dens veldefinerede strukturelle organisation. En fuldstændig forståelse af hjernen kræver at studere forskellige hjerneområder, definere forbindelser og identificere nøgleforskelle i aktiviteterne i hver af disse hjerneområder. En mere omfattende forståelse af hver af disse forskellige regioner kan bane vejen for nye og forbedrede behandlinger inden for neurovidenskab. Heri diskuterer vi en trin-for-trin metode til dissekering af musehjernen i seksten forskellige regioner. I denne procedure har vi fokuseret på hanmus C57Bl/6J (6-8 uger gammel) hjernefjernelse og dissektion i flere regioner ved hjælp af neuroanatomiske landemærker til at identificere og prøve diskret funktionelt relevante og adfærdsmæssigt relevante hjerneområder. Dette arbejde vil hjælpe med at lægge et stærkt fundament inden for neurovidenskab, hvilket fører til mere fokuserede tilgange i den dybere forståelse af hjernens funktion.
Hjernen udgør sammen med rygmarven og nethinden centralnervesystemet, der udfører kompleks adfærd, styret af specialiserede, præcist placerede og interagerende celletyper i hele kroppen1. Hjernen er et komplekst organ med milliarder af sammenkoblede neuroner og glia med præcise kredsløb, der udfører adskillige funktioner. Det er en bilateral struktur med to forskellige lobes og forskellige cellulære komponenter2. Rygmarven forbinder hjernen med omverdenen og er beskyttet af knogler, hjernehinder og cerebrospinalvæske og dirigerer beskeder til og fra hjernen 2,3,4. Hjernens overflade, hjernebarken, er ujævn og har forskellige folder, kaldet gyri, og riller, kaldet sulci, der adskiller hjernen i funktionelle centre5. Cortex er glat hos pattedyr med en lille hjerne 6,7. Det er vigtigt at karakterisere og studere arkitekturen i den menneskelige hjerne for at forstå de lidelser, der er relateret til de forskellige hjerneområder, såvel som dets funktionelle kredsløb. Neurovidenskabelig forskning er udvidet i de senere år, og en række eksperimentelle metoder bruges til at studere hjernens struktur og funktion. Udviklingen inden for molekylær- og systembiologi har indvarslet en ny æra med udforskning af det komplekse forhold mellem hjernestrukturer og molekylers funktion. Derudover vokser molekylærbiologi, genetik og epigenetik hurtigt, hvilket gør det muligt for os at fremme vores viden om de underliggende mekanismer, der er involveret i, hvordan systemer fungerer. Disse analyser kan udføres på et meget mere lokaliseret grundlag for at hjælpe med at målrette undersøgelsen og udviklingen af mere effektive terapier.
Pattedyrshjernen er strukturelt defineret i klart identificerbare diskrete regioner; imidlertid er de funktionelle og molekylære kompleksiteter af disse diskrete strukturer endnu ikke klart forstået. Hjernevævets flerdimensionelle og flerlagede natur gør dette landskab vanskeligt at studere på funktionsniveau. Hertil kommer, at det faktum, at flere funktioner udføres af samme struktur og omvendt, yderligere komplicerer forståelsen af hjernen8. Det er afgørende, at den eksperimentelle tilgang, der udføres til strukturel og funktionel karakterisering af hjerneområder, bruger præcise forskningsmetoder til at opnå konsistens i prøveudtagning for korrelerende neuroanatomisk arkitektur med funktion. Hjernens kompleksitet er for nylig blevet forklaret ved hjælp af enkeltcellesekventering 9,10, såsom den tidlige gyrus i den menneskelige hjerne, der består af 75 forskellige celletyper11. Ved at sammenligne disse data med dem fra en analog region i musehjernen afslører undersøgelsen ikke kun ligheder i deres arkitektur og celletyper, men præsenterer også forskellene. For at opklare de komplekse mekanismer er det derfor vigtigt at studere forskellige områder af hjernen med fuld præcision. Bevarede strukturer og funktion mellem en menneske- og musehjerne muliggør brugen af en mus som en foreløbig surrogat til belysning af menneskelig hjernefunktion og adfærdsmæssige resultater.
Med udviklingen af systembiologiske tilgange er indhentning af information fra diskrete hjerneområder hos gnavere blevet en nøgleprocedure inden for neurovidenskabelig forskning. Mens nogle protokoller såsom laser capture mikrodissektion12 kan være dyre, er mekaniske protokoller billige og udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige værktøjer13,14. Vi har brugt flere hjerneområder til transkriptomiske assays15 og har udviklet en praktisk og hurtig procedure til at dissekere musehjerneområder af interesse på en trinvis måde på kort tid. Når dissekeret, kan disse prøver opbevares straks under kolde forhold for at bevare nukleinsyrer og proteiner i disse væv. Vores tilgang kan udføres hurtigere, hvilket fører til høj effektivitet og giver mindre chancer for vævsforringelse. Dette øger i sidste ende chancerne for at generere reproducerbare eksperimenter af høj kvalitet ved hjælp af hjernevæv.
Pattedyrshjernen er et komplekst organ sammensat af en række morfologisk forskellige og funktionelt unikke celler med forskellige molekylære signaturer og flere regioner, der udfører specialiserede og diskrete funktioner. Dissektionsproceduren, der er rapporteret her, kan have flere mål afhængigt af laboratoriets krav. I vores laboratorium vurderede vi transkription i flere hjerneområder indsamlet fra mus udsat for PTSD som stress16 . Vi vil gerne undersøge yderligere virkningen af stammege…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler og Pamela Spellman for eksperimentel hjælp og Dana Youssef for redigering af manuskriptet. Finansieringsstøtten fra USAMRDC anerkendes taknemmeligt. Geneva Foundation bidrog til dette arbejde og blev støttet af midler fra Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via US Army Research Office.
Ansvarsfraskrivelse:
Materialet er blevet gennemgået af Walter Reed Army Institute of Research. Der er ingen indvendinger mod dens præsentation og/eller offentliggørelse. De meninger eller påstande, der er indeholdt heri, er forfatterens private synspunkter og må ikke opfattes som officielle eller som udtryk for sande synspunkter fra hærens ministerium eller forsvarsministeriet. Forskning blev udført under en godkendt dyrebrugsprotokol i en AAALAC-akkrediteret facilitet i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven og andre føderale vedtægter og regler vedrørende dyr og forsøg, der involverer dyr og overholder principperne i Vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr, NRC-publikation, 2011-udgave.
Brain Removal | |||
Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
Pituitary Dissection | |||
Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
Brain Dissection | |||
A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |