Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's
Summary
We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.
Abstract
De hersenen zijn het commandocentrum voor het zenuwstelsel van zoogdieren en een orgaan met een enorme structurele complexiteit. Beschermd in de schedel, bestaan de hersenen uit een buitenste bedekking van grijze stof over de hemisferen die bekend staat als de hersenschors. Onder deze laag bevinden zich vele andere gespecialiseerde structuren die essentieel zijn voor meerdere fenomenen die belangrijk zijn voor het bestaan. Het verkrijgen van monsters van specifieke grove hersengebieden vereist snelle en nauwkeurige dissectiestappen. Het is duidelijk dat er op microscopisch niveau veel subregio’s bestaan en waarschijnlijk de willekeurige regionale grenzen overschrijden die we opleggen met het oog op deze dissectie.
Muismodellen worden routinematig gebruikt om menselijke hersenfuncties en ziekten te bestuderen. Veranderingen in genexpressiepatronen kunnen beperkt zijn tot specifieke hersengebieden die gericht zijn op een bepaald fenotype, afhankelijk van de zieke toestand. Het is dus van groot belang om de regulering van transcriptie te bestuderen met betrekking tot de goed gedefinieerde structurele organisatie. Een volledig begrip van de hersenen vereist het bestuderen van verschillende hersengebieden, het definiëren van verbindingen en het identificeren van belangrijke verschillen in de activiteiten van elk van deze hersengebieden. Een uitgebreider begrip van elk van deze verschillende regio’s kan de weg vrijmaken voor nieuwe en verbeterde behandelingen op het gebied van neurowetenschappen. Hierin bespreken we een stapsgewijze methodologie voor het ontleden van het muizenbrein in zestien verschillende regio’s. In deze procedure hebben we ons gericht op mannelijke muis C57Bl / 6J (6-8 weken oud) hersenverwijdering en dissectie in meerdere regio’s met behulp van neuroanatomische oriëntatiepunten om discrete functioneel relevante en gedragsrelevante hersengebieden te identificeren en te bemonsteren. Dit werk zal helpen een sterke basis te leggen op het gebied van neurowetenschappen, wat leidt tot meer gerichte benaderingen in het diepere begrip van de hersenfunctie.
Introduction
De hersenen, samen met het ruggenmerg en het netvlies, vormen het centrale zenuwstelsel dat complex gedrag uitvoert, gecontroleerd door gespecialiseerde, nauwkeurig gepositioneerde en interagerende celtypen in het hele lichaam1. De hersenen zijn een complex orgaan met miljarden onderling verbonden neuronen en glia met nauwkeurige circuits die tal van functies uitvoeren. Het is een bilaterale structuur met twee verschillende lobben en diverse cellulaire componenten2. Het ruggenmerg verbindt de hersenen met de buitenwereld en wordt beschermd door bot, hersenvliezen en hersenvocht en routeert berichten van en naar de hersenen 2,3,4. Het oppervlak van de hersenen, de hersenschors, is ongelijk en heeft verschillende plooien, gyri genaamd, en groeven, sulci genaamd, die de hersenen scheiden in functionele centra5. De cortex is glad bij zoogdieren met een klein brein 6,7. Het is belangrijk om de architectuur van het menselijk brein te karakteriseren en te bestuderen om de aandoeningen te begrijpen die verband houden met de verschillende hersengebieden, evenals de functionele circuits ervan. Neurowetenschappelijk onderzoek is de afgelopen jaren uitgebreid en er worden verschillende experimentele methoden gebruikt om de structuur en functie van de hersenen te bestuderen. Ontwikkelingen op het gebied van moleculaire en systeemniveau biologie hebben een nieuw tijdperk ingeluid van het onderzoeken van de complexe relatie tussen hersenstructuren en het functioneren van moleculen. Bovendien breiden moleculaire biologie, genetica en epigenetica zich snel uit, waardoor we onze kennis van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij het functioneren van systemen kunnen vergroten. Deze analyses kunnen op een veel meer gelokaliseerde basis worden uitgevoerd, om te helpen bij het onderzoeken en ontwikkelen van effectievere therapieën.
Het zoogdierbrein is structureel gedefinieerd in duidelijk identificeerbare discrete gebieden; de functionele en moleculaire complexiteit van deze discrete structuren zijn echter nog niet duidelijk begrepen. De multidimensionale en meerlagige aard van het hersenweefsel maakt dit landschap moeilijk te bestuderen op functioneel niveau. Bovendien bemoeilijkt het feit dat meerdere functies door dezelfde structuur worden uitgevoerd en vice versa het begrip van de hersenen verder8. Het is van vitaal belang dat de experimentele benadering die wordt uitgevoerd voor de structurele en functionele karakterisering van hersengebieden nauwkeurige onderzoeksmethoden gebruikt om consistentie te bereiken in bemonstering voor het correleren van neuroanatomische architectuur met functie. De complexiteit van de hersenen is onlangs verklaard met behulp van single cell sequencing 9,10, zoals de temporale gyrus van het menselijk brein die is samengesteld uit 75 verschillende celtypen11. Door deze gegevens te vergelijken met die uit een analoog gebied van het muizenbrein, onthult de studie niet alleen overeenkomsten in hun architectuur en celtypen, maar presenteert ook de verschillen. Om de complexe mechanismen te ontrafelen, is het daarom belangrijk om verschillende hersengebieden met volledige precisie te bestuderen. Geconserveerde structuren en functies tussen een menselijk en muisbrein maken het gebruik van een muis mogelijk als een voorlopig surrogaat voor het ophelderen van de menselijke hersenfunctie en gedragsuitkomsten.
Met de vooruitgang van systeembiologische benaderingen is het verkrijgen van informatie uit discrete hersengebieden bij knaagdieren een belangrijke procedure geworden in neurowetenschappelijk onderzoek. Hoewel sommige protocollen zoals laser capture microdissection12 duur kunnen zijn, zijn mechanische protocollen goedkoop en worden ze uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare tools13,14. We hebben meerdere hersengebieden gebruikt voor transcriptomische assays15 en hebben een hands-on en snelle procedure ontwikkeld om de hersengebieden van muizen die van belang zijn in korte tijd stap voor stap te ontleden. Eenmaal ontleed, kunnen deze monsters onmiddellijk in koude omstandigheden worden opgeslagen om de nucleïnezuren en eiwitten van deze weefsels te behouden. Onze aanpak kan sneller worden uitgevoerd, wat leidt tot een hoge efficiëntie en minder kans op weefselverslechtering mogelijk maakt. Dit verhoogt uiteindelijk de kans op het genereren van hoogwaardige, reproduceerbare experimenten met behulp van hersenweefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het zoogdierbrein is een complex orgaan dat bestaat uit een reeks morfologisch verschillende en functioneel unieke cellen met diverse moleculaire handtekeningen en meerdere regio’s die gespecialiseerde en discrete functies uitvoeren. De hier gerapporteerde dissectieprocedure kan meerdere doelen hebben, afhankelijk van de vereisten van het laboratorium. In ons lab beoordeelden we transcriptie in meerdere hersengebieden verzameld van muizen die werden blootgesteld aan PTSS zoals stress16 . We willen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken mevrouw Seshmalini Srinivasan, de heer Stephen Butler en mevrouw Pamela Spellman voor experimentele hulp en mevrouw Dana Youssef voor het redigeren van het manuscript. De financieringssteun van USAMRDC wordt dankbaar erkend. De Geneva Foundation droeg bij aan dit werk en werd ondersteund door fondsen van het Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via het US Army Research Office.
Disclaimer:
Materiaal is beoordeeld door het Walter Reed Army Institute of Research. Er is geen bezwaar tegen de presentatie en/of publicatie ervan. De meningen of beweringen die hierin zijn opgenomen, zijn de privé-opvattingen van de auteur en mogen niet worden opgevat als officieel, of als een weerspiegeling van ware opvattingen van het ministerie van het leger of het ministerie van Defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een goedgekeurd protocol voor diergebruik in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten met dieren en houdt zich aan de principes die zijn vermeld in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC-publicatie, editie 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
- P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).
