機能的および解剖学的に異なる領域へのマウス脳の微小解剖
Summary
我々は、新鮮な脳組織からの離散領域のマウス脳除去および解剖のための実践的な、段階的、迅速なプロトコルを提示する。分子解析のために脳領域を取得することは、多くの神経科学研究室で日常的になっています。これらの脳領域は直ちに凍結され、システムレベルの解析のための高品質のトランスクリプトームデータが得られます。
Abstract
脳は哺乳類の神経系の司令センターであり、構造的に非常に複雑な器官です。頭蓋骨内で保護された脳は、大脳皮質として知られる半球上の灰白質の外側の覆いで構成されています。この層の下には、存在にとって重要な複数の現象に不可欠な他の多くの特殊な構造があります。特定の総脳領域のサンプルを取得するには、迅速かつ正確な解剖手順が必要です。微視的なレベルでは、多くのサブ領域が存在し、この解剖の目的のために課す任意の地域の境界を越える可能性が高いことが理解される。
マウスモデルは、ヒトの脳機能および疾患を研究するために日常的に使用されている。遺伝子発現パターンの変化は、罹患状態に応じて特定の表現型を標的とする特定の脳領域に限定され得る。したがって、その明確に定義された構造組織に関して転写の調節を研究することは非常に重要です。脳を完全に理解するには、異なる脳領域を研究し、接続を定義し、これらの各脳領域の活動における主要な違いを特定する必要があります。これらの異なる領域のそれぞれをより包括的に理解することは、神経科学の分野における新しく改善された治療への道を開くかもしれない。ここでは、マウスの脳を16の異なる領域に解剖するための段階的な方法論について説明します。この手順では、オスマウスC57Bl/6J(6-8週齢)の脳摘出と、神経解剖学的ランドマークを用いた複数の領域への解剖に焦点を当て、機能的に関連する脳領域と行動的に関連する個別の脳領域を同定し、サンプリングしました。この研究は、神経科学の分野で強力な基盤を築くのに役立ち、脳機能のより深い理解におけるより焦点を絞ったアプローチにつながります。
Introduction
脳は、脊髄および網膜とともに、全身にわたって特殊化され、正確に位置決めされ、相互作用する細胞型によって制御される複雑な行動を実行する中枢神経系を構成する1。脳は、何十億もの相互接続されたニューロンとグリアを持つ複雑な器官であり、多数の機能を果たす正確な回路を備えています。これは、2つの異なる葉と多様な細胞成分2を有する両側構造である。脊髄は脳を外界に接続し、骨、髄膜、脳脊髄液によって保護され、脳との間でメッセージをルーティングします2,3,4。脳の表面である大脳皮質は不均一で、ジャイリと呼ばれる明確なひだと、脳を機能中枢に分離するスルシと呼ばれる溝を持っています5。皮質は小さな脳を持つ哺乳類では滑らかです 6,7.異なる脳領域に関連する障害とその機能回路を理解するために、人間の脳の構造を特徴付け、研究することが重要です。近年、神経科学の研究が拡大し、脳の構造や機能を研究するために様々な実験方法が用いられています。分子・システム生物学の分野における発展は、脳構造と分子の機能との複雑な関係を探る新時代の到来を告げました。さらに、分子生物学、遺伝学、エピジェネティクスは急速に拡大しており、システムの機能に関わる根底にあるメカニズムに関する知識を深めることができます。これらの分析は、より効果的な治療法の調査と開発をターゲットとするのに役立つ、はるかに局所的な基準で実施することができます。
哺乳類の脳は、構造的に明確に識別可能な離散領域に定義されています。しかし、これらの離散構造の機能的および分子的複雑さはまだ明確に理解されていない。脳組織の多次元的で多層的な性質は、この風景を機能レベルで研究することを困難にしています。加えて、複数の機能が同じ構造によって実行されるという事実、およびその逆もまた同様であるという事実は、脳8の理解をさらに複雑にする。脳領域の構造的および機能的特徴付けのために実行される実験的アプローチは、神経解剖学的アーキテクチャと機能を相関させるためのサンプリングの一貫性を達成するために、正確な研究方法論を使用することが極めて重要である。脳の複雑さは、最近、75の異なる細胞型11から構成されるヒト脳の側頭回のような単一細胞シーケンシング9,10を用いて説明されている。このデータをマウス脳の類似領域からのデータと比較することにより、この研究はそれらの構造と細胞型の類似性を明らかにするだけでなく、違いも提示する。したがって、複雑なメカニズムを解明するためには、脳の多様な領域を完全な精度で研究することが重要です。ヒトとマウスの脳間の保存された構造と機能は、人間の脳機能と行動結果を解明するための予備的な代理としてマウスを使用することを可能にします。
システム生物学のアプローチの進歩に伴い、げっ歯類の離散的な脳領域から情報を得ることは、神経科学研究における重要な手順となっている。レーザー捕捉微小解剖12 などのいくつかのプロトコルは高価であり得るが、機械的プロトコルは安価であり、一般的に入手可能なツール13、14を用いて実行される。我々は、トランスクリプトームアッセイ15 に複数の脳領域を使用し、関心のあるマウス脳領域を短時間で段階的に解剖する実践的かつ迅速な手順を開発しました。解剖されると、これらのサンプルを直ちに低温条件下で保存して、これらの組織の核酸およびタンパク質を保存することができます。当社のアプローチはより迅速に実行でき、高効率を実現し、組織劣化の可能性を低く抑えることができます。これは最終的に、脳組織を使用して高品質で再現可能な実験を生成する可能性を高めます。
Protocol
Representative Results
Discussion
哺乳類の脳は、多様な分子シグネチャを持つ形態学的に明確で機能的にユニークな細胞の配列と、特殊で離散的な機能を実行する複数の領域で構成される複雑な器官です。ここで報告する解剖手順は、ラボの要件に応じて複数の目標を持つことができます。私たちの研究室では、ストレスのようなPTSDに曝露されたマウスから採取した複数の脳領域における転写を評価した16 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
セシュマリニ・スリニヴァサン氏、スティーブン・バトラー氏、パメラ・スペルマン氏には実験的な支援をいただき、ダナ・ユセフ氏は原稿の編集に感謝いたします。USAMRDCからの資金援助は感謝の意をもって認められています。ジュネーブ財団はこの作業に貢献し、米国陸軍研究局を通じて軍事および運用医学研究地域局IIIからの資金によって支援されました。
免責事項：
資料はウォルター・リード陸軍研究所によってレビューされています。そのプレゼンテーションおよび/または出版に異議はありません。ここに含まれる意見または主張は、著者の私的見解であり、公式として、または陸軍省または国防総省の真の見解を反映していると解釈されるべきではありません。研究は、動物福祉法および動物を含む実験に関するその他の連邦法令および規制に準拠し、AAALAC認定施設で承認された動物使用プロトコルに基づいて実施され、 実験動物のケアおよび使用のためのガイド、NRCパブリケーション、2011年版に記載されている原則を遵守します。
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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