Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes
Summary
Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.
Abstract
O cérebro é o centro de comando do sistema nervoso mamífero e um órgão com enorme complexidade estrutural. Protegido dentro do crânio, o cérebro consiste em uma cobertura externa de matéria cinzenta sobre os hemisférios conhecidos como córtex cerebral. Abaixo dessa camada residem muitas outras estruturas especializadas que são essenciais para múltiplos fenômenos importantes para a existência. A aquisição de amostras de regiões cerebrais brutas específicas requer passos de dissecção rápidos e precisos. Entende-se que, no nível microscópico, existem muitas sub-regiões e provavelmente cruzam as fronteiras regionais arbitrárias que impomos para efeitos desta dissecção.
Modelos de camundongos são usados rotineiramente para estudar funções e doenças cerebrais humanas. Alterações nos padrões de expressão genética podem estar confinadas a áreas cerebrais específicas visando um fenótipo específico, dependendo do estado doente. Assim, é de grande importância estudar a regulação da transcrição no que diz respeito à sua organização estrutural bem definida. Uma compreensão completa do cérebro requer estudar regiões cerebrais distintas, definir conexões e identificar diferenças fundamentais nas atividades de cada uma dessas regiões cerebrais. Uma compreensão mais abrangente de cada uma dessas regiões distintas pode abrir caminho para novos e aprimorados tratamentos no campo da neurociência. Aqui, discutimos uma metodologia passo a passo para dissecar o cérebro do rato em dezesseis regiões distintas. Neste procedimento, focamos na remoção e dissecção cerebral do camundongo C57Bl/6J (6-8 semanas) em múltiplas regiões usando marcos neuroanatomáticos para identificar e amostrar regiões cerebrais discretas e relevantes do funcionamento e comportamentalmente relevantes. Este trabalho ajudará a estabelecer uma base forte no campo da neurociência, levando a abordagens mais focadas na compreensão mais profunda da função cerebral.
Introduction
O cérebro, juntamente com a medula espinhal e a retina, compreendem o sistema nervoso central que executa comportamentos complexos, controlados por tipos de células especializadas, precisamente posicionadas e interagindo em todo o corpo1. O cérebro é um órgão complexo com bilhões de neurônios interconectados e glia com circuitos precisos realizando inúmeras funções. É uma estrutura bilateral com dois lobos distintos e diversos componentes celulares2. A medula espinhal conecta o cérebro ao mundo exterior e é protegida por ossos, meninges e fluido cefalorraquidiano e encaminha mensagens de e para o cérebro 2,3,4. A superfície do cérebro, o córtex cerebral, é desigual e tem dobras distintas, chamadas gyri, e sulcos, chamados sulci, que separam o cérebro em centros funcionais5. O córtex é suave em mamíferos com um cérebro pequeno 6,7. É importante caracterizar e estudar a arquitetura do cérebro humano para entender os transtornos relacionados às diferentes regiões cerebrais, bem como seus circuitos funcionais. A pesquisa em neurociências se expandiu nos últimos anos e uma variedade de métodos experimentais estão sendo usados para estudar a estrutura e a função do cérebro. Desenvolvimentos nos campos da biologia molecular e de nível de sistemas iniciaram uma nova era de exploração da complexa relação entre estruturas cerebrais e o funcionamento das moléculas. Além disso, biologia molecular, genética e epigenética estão se expandindo rapidamente, permitindo-nos avançar nosso conhecimento dos mecanismos subjacentes envolvidos na forma como os sistemas funcionam. Essas análises podem ser realizadas de forma muito mais localizada, para ajudar na investigação e desenvolvimento de terapias mais eficazes.
O cérebro mamífero é estruturalmente definido em regiões discretas claramente identificáveis; no entanto, as complexidades funcionais e moleculares dessas estruturas discretas ainda não são claramente compreendidas. A natureza multidimensional e multicamadas do tecido cerebral torna essa paisagem difícil de estudar no nível funcional. Além disso, o fato de que múltiplas funções são executadas pela mesma estrutura e vice-versa complica ainda mais a compreensão do cérebro8. É vital que a abordagem experimental executada para a caracterização estrutural e funcional das regiões cerebrais utilize metodologias precisas de pesquisa para obter consistência na amostragem para correlacionar arquitetura neuroanatomical com função. A complexidade do cérebro foi recentemente explicada usando sequenciamento de células únicas 9,10, como o giro temporal do cérebro humano que é composto por 75 tipos de células distintas11. Comparando esses dados com os de uma região análoga do cérebro do camundongo, o estudo não só revela semelhanças em sua arquitetura e tipos celulares, mas também apresenta as diferenças. Para desvendar os mecanismos complexos, é importante, portanto, estudar diversas regiões do cérebro com plena precisão. Estruturas conservadas e função entre um cérebro humano e rato permitem o uso de um rato como substituto preliminar para elucidar a função cerebral humana e os resultados comportamentais.
Com o avanço das abordagens de biologia de sistemas, a obtenção de informações de regiões cerebrais discretas em roedores tornou-se um procedimento fundamental na pesquisa em neurociência. Embora alguns protocolos como a microdisseção de captura a laser12 possam ser caros, os protocolos mecânicos são baratos e realizados usando ferramentas comumente disponíveis13,14. Usamos várias regiões cerebrais para ensaios transcriômicos15 e desenvolvemos um procedimento prático e rápido para dissecar regiões cerebrais de camundongos de interesse de forma passo a passo em pouco tempo. Uma vez dissecadas, essas amostras podem ser armazenadas imediatamente em condições frias para preservar os ácidos nucleicos e proteínas desses tecidos. Nossa abordagem pode ser realizada mais rapidamente, levando a alta eficiência e permitindo menos chances de deterioração tecidual. Isso, em última análise, aumenta as chances de gerar experimentos reprodutíveis de alta qualidade usando tecidos cerebrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O cérebro mamífero é um órgão complexo composto por uma matriz de células morfologicamente distintas e funcionalmente únicas com diversas assinaturas moleculares e múltiplas regiões que realizam funções especializadas e discretas. O procedimento de dissecção aqui relatado pode ter múltiplas metas dependendo dos requisitos do laboratório. Em nosso laboratório avaliamos a transcrição em várias regiões cerebrais coletadas de camundongos expostos ao TEPT como o estresse16 . Gostar?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Sra. Seshmalini Srinivasan, ao Sr. Stephen Butler e à Sra. Pamela Spellman por assistência experimental e à Sra. Dana Youssef por editar o manuscrito. O apoio ao financiamento da USAMRDC é reconhecido com gratidão. A Fundação Genebra contribuiu para este trabalho e foi apoiada por fundos da Área de Pesquisa de Medicina Militar e Operacional III através do Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA.
Disclaimer:
O material foi revisado pelo Instituto de Pesquisa do Exército Walter Reed. Não há objeção à sua apresentação e/ou publicação. As opiniões ou afirmações aqui contidas são as opiniões privadas do autor, e não devem ser interpretadas como oficiais, ou como refletir verdadeiras visões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. A pesquisa foi conduzida sob um protocolo aprovado de uso de animais em uma instalação credenciada pela AAALAC em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e outros estatutos e regulamentos federais relativos a animais e experimentos envolvendo animais e adere aos princípios indicados no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Edição NRC Publication, edição de 2011.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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