Микродиссекция мозга мыши на функционально и анатомически различные области
Summary
Мы представляем практический, пошаговый, быстрый протокол для удаления мозга мыши и рассечения дискретных областей из свежей мозговой ткани. Получение областей мозга для молекулярного анализа стало рутиной во многих лабораториях нейробиологии. Эти области мозга немедленно замораживаются для получения высококачественных транскриптомных данных для анализа на системном уровне.
Abstract
Мозг является командным центром нервной системы млекопитающих и органом с огромной структурной сложностью. Защищенный внутри черепа, мозг состоит из внешнего покрытия серого вещества над полушариями, известного как кора головного мозга. Под этим слоем находятся многие другие специализированные структуры, которые необходимы для множественных явлений, важных для существования. Получение образцов конкретных грубых областей мозга требует быстрых и точных этапов рассечения. Понятно, что на микроскопическом уровне существует много субрегионов и, вероятно, пересекают произвольные региональные границы, которые мы налагаем с целью этого вскрытия.
Мышиные модели обычно используются для изучения функций и заболеваний человеческого мозга. Изменения в паттернах экспрессии генов могут быть ограничены конкретными областями мозга, нацеленными на определенный фенотип в зависимости от болезненного состояния. Таким образом, большое значение имеет изучение регуляции транскрипции в отношении ее четко определенной структурной организации. Полное понимание мозга требует изучения различных областей мозга, определения связей и выявления ключевых различий в деятельности каждой из этих областей мозга. Более полное понимание каждой из этих отдельных областей может проложить путь для новых и улучшенных методов лечения в области неврологии. Здесь мы обсуждаем пошаговую методологию рассечения мозга мыши на шестнадцать различных областей. В этой процедуре мы сосредоточились на удалении и рассечении мозга самцов мышей C57Bl / 6J (6-8 недель) на несколько областей с использованием нейроанатомических ориентиров для выявления и выборки дискретных функционально значимых и поведенчески значимых областей мозга. Эта работа поможет заложить прочный фундамент в области нейробиологии, что приведет к более целенаправленным подходам в более глубоком понимании функции мозга.
Introduction
Головной мозг, наряду со спинным мозгом и сетчаткой, составляет центральную нервную систему, которая выполняет сложное поведение, контролируемое специализированными, точно расположенными и взаимодействующими типами клеток по всему телу1. Мозг представляет собой сложный орган с миллиардами взаимосвязанных нейронов и глии с точной схемой, выполняющей многочисленные функции. Это двусторонняя структура с двумя различными долями и разнообразными клеточными компонентами2. Спинной мозг соединяет головной мозг с внешним миром и защищен костью, мозговыми оболочками и спинномозговой жидкостью и направляет сообщения в мозг и из него 2,3,4. Поверхность мозга, кора головного мозга, неровная и имеет отчетливые складки, называемые извилинами, и бороздки, называемые бороздами, которые разделяют мозг на функциональные центры5. Кора гладкая у млекопитающих с небольшим мозгом 6,7. Важно охарактеризовать и изучить архитектуру человеческого мозга, чтобы понять расстройства, связанные с различными областями мозга, а также его функциональными схемами. В последние годы исследования в области неврологии расширились, и для изучения структуры и функции мозга используются различные экспериментальные методы. Разработки в области молекулярной и системной биологии открыли новую эру изучения сложных отношений между структурами мозга и функционированием молекул. Кроме того, молекулярная биология, генетика и эпигенетика быстро расширяются, что позволяет нам продвигать наши знания об основных механизмах, связанных с функционированием систем. Эти анализы могут проводиться на гораздо более локализованной основе, чтобы помочь целенаправленно исследовать и разработать более эффективные методы лечения.
Мозг млекопитающих структурно определен в четко идентифицируемые дискретные области; однако функциональные и молекулярные сложности этих дискретных структур еще не ясно поняты. Многомерность и многослойность мозговой ткани затрудняет изучение этого ландшафта на функциональном уровне. Кроме того, тот факт, что несколько функций выполняются одной и той же структурой и наоборот, еще больше усложняет понимание мозга8. Крайне важно, чтобы экспериментальный подход, выполненный для структурной и функциональной характеристики областей мозга, использовал точные исследовательские методологии для достижения согласованности в выборке для корреляции нейроанатомической архитектуры с функцией. Сложность мозга была недавно объяснена с использованием секвенирования одиночных клеток 9,10, таких как височная извилина человеческого мозга, которая состоит из 75 различных типов клеток11. Сравнивая эти данные с данными из аналогичной области мозга мыши, исследование не только выявляет сходство в их архитектуре и типах клеток, но и представляет различия. Чтобы разгадать сложные механизмы, важно изучать различные области мозга с полной точностью. Сохраненные структуры и функции между мозгом человека и мыши позволяют использовать мышь в качестве предварительного суррогата для выяснения функции человеческого мозга и поведенческих результатов.
С развитием подходов системной биологии получение информации из дискретных областей мозга у грызунов стало ключевой процедурой в исследованиях нейробиологии. В то время как некоторые протоколы, такие как микродиссекция12 лазерного захвата, могут быть дорогостоящими, механические протоколы недороги и выполняются с использованием общедоступных инструментов13,14. Мы использовали несколько областей мозга для транскриптомных анализов15 и разработали практическую и быструю процедуру для пошагового рассечения областей мозга мыши шаг за шагом за короткое время. После вскрытия эти образцы могут быть сохранены сразу в холодных условиях для сохранения нуклеиновых кислот и белков этих тканей. Наш подход может быть выполнен быстрее, что приводит к высокой эффективности и позволяет снизить вероятность ухудшения состояния тканей. Это, в конечном счете, увеличивает шансы на создание высококачественных, воспроизводимых экспериментов с использованием тканей мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мозг млекопитающих представляет собой сложный орган, состоящий из массива морфологически различных и функционально уникальных клеток с разнообразными молекулярными сигнатурами и несколькими областями, которые выполняют специализированные и дискретные функции. Процедура вскрытия, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Сешмалини Сринивасан, г-на Стивена Батлера и г-жу Памелу Спеллман за экспериментальную помощь и г-жу Дану Юсеф за редактирование рукописи. Финансовая поддержка со стороны USAMRDC благодарна. Женевский фонд внес свой вклад в эту работу и был поддержан средствами Из Управления исследований военной и оперативной медицины III через Исследовательское управление армии США.
Отказ:
Материал был рассмотрен Институтом исследований армии Уолтера Рида. Нет никаких возражений против его представления и/или публикации. Мнения или утверждения, содержащиеся в настоящем документе, являются частными взглядами автора и не должны толковаться как официальные или как отражающие истинные взгляды Министерства армии или Министерства обороны. Исследования проводились в соответствии с утвержденным протоколом использования животных в аккредитованном AAALAC учреждении в соответствии с Законом о благополучии животных и другими федеральными законами и правилами, касающимися животных и экспериментов с участием животных, и придерживаются принципов, изложенных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, публикация NRC, издание 2011 года.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
- P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).
