Mikrodissektion av mushjärnan i funktionellt och anatomiskt olika regioner

Summary

Vi presenterar ett praktiskt, steg-för-steg, snabbt protokoll för borttagning av mushjärnor och dissektion av diskreta regioner från färsk hjärnvävnad. Att få hjärnregioner för molekylär analys har blivit rutin i många neurovetenskapliga laboratorier. Dessa hjärnregioner fryses omedelbart för att erhålla transkriptomiska data av hög kvalitet för analys på systemnivå.

Abstract

Hjärnan är kommandocentralen för däggdjurens nervsystem och ett organ med enorm strukturell komplexitet. Skyddad i skallen består hjärnan av ett yttre täcke av grå substans över halvklotet som kallas hjärnbarken. Under detta lager finns många andra specialiserade strukturer som är väsentliga för flera fenomen som är viktiga för existensen. Att förvärva prover av specifika grova hjärnregioner kräver snabba och exakta dissektionssteg. Det är underförstått att på mikroskopisk nivå finns många delregioner och sannolikt korsar de godtyckliga regionala gränser som vi inför för denna dissektion.

Musmodeller används rutinmässigt för att studera mänskliga hjärnfunktioner och sjukdomar. Förändringar i genuttrycksmönster kan begränsas till specifika hjärnområden som riktar sig mot en viss fenotyp beroende på det sjuka tillståndet. Således är det av stor betydelse att studera reglering av transkription med avseende på dess väldefinierade strukturella organisation. En fullständig förståelse av hjärnan kräver att man studerar distinkta hjärnregioner, definierar anslutningar och identifierar viktiga skillnader i aktiviteterna i var och en av dessa hjärnregioner. En mer omfattande förståelse av var och en av dessa distinkta regioner kan bana väg för nya och förbättrade behandlingar inom neurovetenskap. Häri diskuterar vi en steg-för-steg-metod för att dissekera mushjärnan i sexton distinkta regioner. I denna procedur har vi fokuserat på manlig mus C57Bl / 6J (6-8 veckor gammal) hjärnborttagning och dissektion i flera regioner med hjälp av neuroanatomiska landmärken för att identifiera och prova diskreta funktionellt relevanta och beteenderelevanta hjärnregioner. Detta arbete kommer att bidra till att lägga en stark grund inom neurovetenskap, vilket leder till mer fokuserade tillvägagångssätt för den djupare förståelsen av hjärnans funktion.

Introduction

Hjärnan, tillsammans med ryggmärgen och näthinnan, utgör centrala nervsystemet som utför komplexa beteenden, styrda av specialiserade, exakt positionerade och interagerande celltyper i hela kroppen¹. Hjärnan är ett komplext organ med miljarder sammankopplade neuroner och glia med exakta kretsar som utför många funktioner. Det är en bilateral struktur med två distinkta lober och olika cellulära komponenter². Ryggmärgen förbinder hjärnan med omvärlden och skyddas av ben, hjärnhinnor och ryggmärgsvätska och leder meddelanden till och från hjärnan ^2,3,4. Hjärnans yta, hjärnbarken, är ojämn och har distinkta veck, kallade gyri, och spår, kallade sulci, som separerar hjärnan i funktionella centra⁵. Cortex är slät hos däggdjur med en liten hjärna ^6,7. Det är viktigt att karakterisera och studera den mänskliga hjärnans arkitektur för att förstå störningarna relaterade till de olika hjärnregionerna, liksom dess funktionella kretsar. Neurovetenskaplig forskning har expanderat de senaste åren och en mängd experimentella metoder används för att studera hjärnans struktur och funktion. Utvecklingen inom molekylär- och systembiologi har inlett en ny era av att utforska det komplexa förhållandet mellan hjärnstrukturer och molekylers funktion. Dessutom expanderar molekylärbiologi, genetik och epigenetik snabbt, vilket gör det möjligt för oss att öka vår kunskap om de underliggande mekanismerna som är involverade i hur system fungerar. Dessa analyser kan utföras på en mycket mer lokaliserad basis för att hjälpa till att rikta in sig på utredning och utveckling av effektivare terapier.

Däggdjurshjärnan är strukturellt definierad i tydligt identifierbara diskreta regioner; De funktionella och molekylära komplexiteterna hos dessa diskreta strukturer är emellertid ännu inte klart förstådda. Hjärnvävnadens flerdimensionella och flerskiktade natur gör detta landskap svårt att studera på funktionell nivå. Dessutom komplicerar det faktum att flera funktioner utförs av samma struktur och vice versa ytterligare förståelsen av hjärnan⁸. Det är viktigt att det experimentella tillvägagångssättet som utförs för strukturell och funktionell karakterisering av hjärnregioner använder exakta forskningsmetoder för att uppnå konsistens i provtagning för att korrelera neuroanatomisk arkitektur med funktion. Hjärnans komplexitet har nyligen förklarats med hjälp av encellssekvensering ^9,10, såsom den mänskliga hjärnans temporala gyrus som består av 75 distinkta celltyper ¹¹. Genom att jämföra dessa data med dem från en analog region i mushjärnan avslöjar studien inte bara likheter i deras arkitektur och celltyper utan presenterar också skillnaderna. För att reda ut de komplexa mekanismerna är det därför viktigt att studera olika regioner i hjärnan med full precision. Bevarade strukturer och funktion mellan en mänsklig och mushjärna möjliggör användning av en mus som ett preliminärt surrogat för att belysa mänsklig hjärnfunktion och beteendemässiga resultat.

Med utvecklingen av systembiologiska tillvägagångssätt har det blivit ett nyckelförfarande inom neurovetenskaplig forskning att få information från diskreta hjärnregioner hos gnagare. Medan vissa protokoll som laserfångstmikrodissektion¹² kan vara dyra, är mekaniska protokoll billiga och utförs med hjälp av allmänt tillgängliga verktyg^13,14. Vi har använt flera hjärnregioner för transkriptomiska analyser¹⁵ och har utvecklat en praktisk och snabb procedur för att dissekera mushjärnregioner av intresse steg för steg på kort tid. När de har dissekerats kan dessa prover lagras omedelbart under kalla förhållanden för att bevara nukleinsyrorna och proteinerna i dessa vävnader. Vårt tillvägagångssätt kan utföras snabbare vilket leder till hög effektivitet och tillåter mindre risk för vävnadsförsämring. Detta ökar i slutändan chanserna att generera högkvalitativa, reproducerbara experiment med hjärnvävnader.

Protocol

Djurhantering och försöksförfaranden genomfördes i enlighet med europeiska, nationella och institutionella riktlinjer för djurvård. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid US Army Center for Environmental Health Research nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) och utfördes i en anläggning ackrediterad av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).OBS: Proceduren kommer att utföras på sex till åt…

Representative Results

Vår förståelse av hjärnans komplexa struktur och funktion utvecklas och förbättras snabbt. Hjärnan innehåller flera distinkta regioner och att bygga en molekylär karta kan hjälpa oss att bättre förstå hur hjärnan fungerar. I detta metoddokument har vi diskuterat dissektion av mushjärnan i flera distinkta regioner (tabell 1). I detta protokoll identifieras strukturerna baserat på de kritiska landmärkena och uppnås genom att hålla vävnaden fuktig med saltlösning genom att behålla dess…

Discussion

Däggdjurshjärnan är ett komplext organ som består av en rad morfologiskt distinkta och funktionellt unika celler med olika molekylära signaturer och flera regioner som utför specialiserade och diskreta funktioner. Dissektionsproceduren som rapporteras här kan ha flera mål beroende på labbets krav. I vårt laboratorium bedömde vi transkription i flera hjärnregioner som samlats in från möss som utsatts för PTSD som stress¹⁶ . Vi vill studera vidare effekterna av stamgenetisk bakgrund<s…

Materials

Brain Removal
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6762	5.5" straight sharp/sharp
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6763	5.5" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6703	4.75" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6702	4.75" straight sharp/sharp
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved Sharp/Sharp
Micro spatula, radius and tapered flat ends			stainless steel mirror finish
Operating scissors 6.5"	Roboz Surgical Store	RS-6846	curved sharp/sharp
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160	4.5” 1X2 teeth 2mm tip width
Rongeur (optional)	Roboz Surgical Store	RS-8321 many styles to choose	Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades	Roboz Surgical Store	RS-9801-11	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Super fine forceps Inox	Roboz Surgical Store	RS-4955	tip size 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A magnification visor	Penn Tool Col	40-178-6	2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier
Dissection cold plate	Cellpath.com	JRI-0100-00A	Iceberg cold plate & base
Graefe forceps, full curve extra delicate	Roboz Surgical Store	RS-5138	0.5 mm Tip 4” (10 cm) long
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved sharp/sharp
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843 (repeated above)	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades (especially #11)	Roboz Surgical Store	RS-9801-11 (repeated above)	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Spatula	Amazon	MS-SQRD9-4	Double Ended Spatula Square AND Round End
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160 (repeated above)	4.5” 1X2 teeth